miR-181a通過激活mTOR信號通路參與學習記憶的形成.pdf

1、學習記憶的鞏固過程是將獲取的短時記憶轉變?yōu)殚L時記憶的漸變過程。近年來的研究發(fā)現，基因和蛋白信號通路的激活表達等過程都參與了記憶的鞏固過程。記憶獲得后的基因轉錄表達和蛋白合成對記憶的鞏固過程起到十分重要的作用。然而，目前已經發(fā)現的miRNA有成千上萬種之多，這么多的miRNA是否都在學習記憶過程中發(fā)揮作用？不同的miRNA在學習記憶中發(fā)揮相同還是不同的作用？哪些miRNA參與海馬腦區(qū)的學習記憶過程？這一問題目前尚不清楚。
　　目的:

2、
　　探究在CFC(場景性恐懼記憶)記憶鞏固過程中發(fā)生內在表達變化miRNA;通過特異性阻斷或過表達這些miRNA，在動物整體水平探究缺失或過表達特異的miRNA后對學習記憶鞏固過程的影響，明確這些miRNA在學習記憶過程中的功能，并探究其分子調控機制，確定其參與學習記憶鞏固過程所調控的靶基因或信號通路，為今后以特異性miRNA為靶點改善神經退行性疾病所造成的記憶缺陷提供理論依據。
　　方法:
　　1. 探究在CFC訓

3、練后海馬腦區(qū)發(fā)生表達變化的miRNA
　　1.1 通過基因芯片分析CFC訓練后海馬腦區(qū)發(fā)生變化的miRNA
　　取8周大小的C57/BL6雄性小鼠，進行CFC訓練，在CFC訓練后1小時取海馬腦區(qū)，以單獨給予足底電擊刺激后1小時的海馬腦區(qū)為其對照，在杭州聯川生物有限公司進行基因芯片分析，對芯片結果中信號強度大于500的miRNA進行分析，找到在CFC訓練后發(fā)生顯著變化的miRNA。
　　1.2 RT-PCR驗證上述被篩選

4、出來的miRNA在CFC訓練后1小時的變化
　　我們將上述基因芯片篩選出來的所有miRNA進行RT-PCR的驗證，發(fā)現在CFC訓練1小時之后miR-181a，miR-126，miR-222，miR-143，miR-151a等miRNA水平上調，而miR-125，miR-690二者的水平下調。
　　1.3 海馬腦區(qū)特異性阻斷上述miRNA后檢測其對小鼠CFC學習記憶的影響
　　我們采用不同的antagomirs來特異性阻

5、斷相應的miRNA。我們在給小鼠海馬腦區(qū)分別注射miR-143和miR-181a的antagomirs之后，進行CFC訓練及測試，結果發(fā)現海馬腦區(qū)miR-143被阻斷后對場景性恐懼記憶的獲得和鞏固過程均無影響;而阻斷miR-181a后小鼠場景性恐懼記憶的獲得并未受到影響，而鞏固過程則受到明顯損傷，這個實驗說明miR-181a參與小鼠CFC的鞏固過程，而miR-143則可能不參與。接下來，為了驗證其他有變化的miRNA在海馬依賴性學習記憶

6、中的功能，我們會繼續(xù)將不同miRNA的antagomirs注射進小鼠海馬腦區(qū)，進行CFC訓練和測試，觀察其是否對小鼠的學習記憶功能產生影響。
　　1.4 海馬腦區(qū)特異性過表達上述miRNA后對CFC學習記憶的影響
　　我們將采用慢病毒注射的方式在海馬腦區(qū)來特異性過表達不同的miRNA，在注射過表達慢病毒四周后進行CFC訓練和測試，觀察過表達miR-181a或其他miRNA能否對小鼠場景性恐懼記憶產生影響。
　　2. 探

7、究miR-181a及其他miRNA參與CFC記憶鞏固過程的調控機制
　　2.1 Luciferase reporter assay驗證miR-181a對PRKAA1和REDD1的調控
　　通過前期實驗發(fā)現，miR-181a參與海馬腦區(qū)CFC記憶的鞏固過程。miRNA在細胞中通常是作為一種轉錄抑制因子而存在，那么miR-181a究竟是通過調控何種靶基因來參與海馬腦區(qū)CFC記憶的鞏固過程的呢？我們首先通過不同的軟件（Target

8、scan，miR-22，miRDB，microcosm）預測在細胞中可能受到miR-181a調控的靶基因，然后將每個軟件預測出的結果通過KEGG分析這些受miR-181a調控的靶基因所在的信號通路，最后將這四個軟件的KEGG分析結果取交集，縮小篩選范圍。通過這種方法，我們發(fā)現mTOR信號通路中的PRKAA1和REDD1這兩個蛋白可能是受到miR-181a調控的靶基因。為了驗證我們的預測是否準確，我們將這幾個基因與miR-181a結合的3

9、'UTR區(qū)域連接到特殊的質粒上，并將其種子序列進行了突變處理作為對照，然后分組進行Luciferase reporter assay實驗，驗證PRKAA1和REDD1在細胞中是否受到miR-181a的直接調控。
　　2.2 CFC訓練后miR-181a對PRKAA1和REDD1蛋白變化的調控
　　我們擬在CFC訓練之后0小時，1小時，2小時，4小時，8小時分別取材，檢測這兩個蛋白的表達水平。接下來，我們想通過在小鼠海馬腦區(qū)注

10、射antagomirs來特異性阻斷海馬腦區(qū)的miR-181a，然后再給予小鼠CFC訓練刺激，最后取出小鼠海馬腦區(qū)檢測在阻斷miR-181a后，CFC訓練刺激能否依然降低PRKAA1和REDD1的蛋白水平。通過上述實驗，我們將判斷在CFC記憶過程中，miR-181a能否調控PRKAA1和REDD1這兩個靶蛋白。
　　2.3 miR-181a參與CFC記憶的鞏固過程依賴其靶基因PRKAA1和REDD1
　　為了更深入的研究miR

11、-181a能否調控靶基因PRKAA1和REDD1參與海馬CFC記憶的鞏固過程，我們將在行為學層次探究miR-181a參與海馬CFC記憶的鞏固是否依賴于PRKAA1和REDD1這兩個靶基因。
　　3. 探究miR-181a對mTOR信號通路的調控
　　我們首先擬在CFC之后不同時間點檢測mTOR蛋白的活性變化。接下來我們首先要探究海馬腦區(qū)miR-181a在CFC訓練后能否調控mTOR蛋白的活性。我們在小鼠海馬腦區(qū)注射miR-1

12、81a的antagomirs來阻斷miR-181a，然后對這些小鼠進行CFC訓練，訓練結束后4小時取出小鼠海馬腦區(qū)，檢測mTOR蛋白活性的變化，觀察阻斷miR-181a之后能否阻斷CFC訓練引起的mTOR蛋白活性升高，以此來觀察在CFC記憶鞏固過程中miR-181a能否調控mTOR蛋白的活性變化。
　　結果:
　　1. CFC訓練之后1小時海馬腦區(qū)miR-181a的表達升高
　　我們在CFC訓練后1小時和6小時取小鼠海

13、馬腦區(qū)，通過RT-PCR驗證發(fā)現，在CFC訓練后1小時，miR-181a表達顯著升高，而單獨給予環(huán)境暴露或足底電擊刺激并不能提高miR-181a的表達水平。
　　2. miR-181a參與調控小鼠CFC記憶的鞏固過程
　　我們將小鼠海馬腦區(qū)miR-181a阻斷后，進行CFC訓練和測試后發(fā)現，阻斷小鼠海馬腦區(qū)miR-181a并不影響小鼠CFC訓練和短時記憶，但損傷了小鼠CFC的長時記憶。相反，過表達miR-181a后，在低電流

14、刺激下，小鼠CFC記憶的鞏固過程顯著增強。隨后，我們發(fā)現，阻斷小鼠海馬腦區(qū)miR-181a并不影響小鼠的運動能力及焦慮樣行為。
　　3. miR-181a調控的靶基因篩選
　　我們首先采用Targetscan，miR-22，miRDB，microcosm這四種預測軟件預測miR-181a可能調控的靶基因。隨后采用KEGG分析方法，將每一種軟件預測出的眾多靶基因都用KEGG分析其所在的信號通路。最后將四種軟件的KEGG分析結果

15、取交集。我們發(fā)現所有預測出的信號通路中都包含mTOR信號通路。在mTOR信號通路中，PRKAA1和REDD1這兩個分子都被預測到可能受miR-181a的調控。我們通過luciferase reporter assay實驗驗證發(fā)現，PRKAA1和REDD1在細胞中受到miR-181a的調控，是miR-181a的靶基因。
　　4. PRKAA1和REDD1在CFC訓練之后的表達下調受到miR-181a的調控
　　我們取na(i)

16、ve以及CFC訓練后0小時，1小時，2小時，4小時和8小時小鼠的海馬腦區(qū)，檢測其中PRKAA1、REDD1和mTOR活性的變化情況。實驗結果表明，在CFC訓練后4小時，PRKAA1和REDD1的蛋白水平顯著下調，而mTOR活性水平顯著升高。當阻斷小鼠海馬腦區(qū)的miR-181a后，小鼠海馬腦區(qū)的PRKAA1和REDD1蛋白水平顯著提升，而CFC訓練刺激能夠顯著降低PRKAA1和REDD1的蛋白水平;當阻斷miR-181a后再進行CFC訓練

17、刺激后小鼠海馬腦區(qū)的PRKAA1和REDD1蛋白水平則不再下調，而mTOR活性也不再升高。這個實驗說明，在CFC訓練后，小鼠海馬腦區(qū)的miR-181a能夠調控mTOR信號通路的蛋白變化。
　　實驗結論:
　　1. 通過本課題的研究，我們發(fā)現miR-181a參與了小鼠海馬腦區(qū)的CFC記憶的鞏固過程。
　　2. 通過軟件預測和luciferase reporter assay實驗驗證發(fā)現miR-181a能夠調控mTOR信號

18、通路中的兩個上游分子PRKAA1和REDD1。
　　3. 我們發(fā)現PRKAA1和REDD1能夠參與小鼠海馬腦區(qū)CFC記憶的鞏固過程。
　　4. 我們確定了在小鼠海馬腦區(qū)CFC訓練過程中，上調的miR-181a能夠抑制靶蛋白PRKAA1和REDD1的表達，繼而激活mTOR蛋白，最終參與CFC記憶的鞏固過程。
　　5. 我們的實驗為進一步了解miRNA在學習記憶中的功能提供了理論基礎，為日后以miRNA為基礎治療臨床疾病提