Hcy誘導(dǎo)的MMP在冠心病發(fā)病機制中的作用及他汀的逆轉(zhuǎn).pdf

1、目的:
　　 觀察不同濃度同型半胱氨酸(Hcy)對培養(yǎng)的大鼠主動脈血管平滑肌細胞(VSMC)基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)表達的影響及動物模型的藥物干預(yù)作用。
　　 方法:
　　 本課題進行了細胞水平和動物水平兩方面的實驗研究:
　　 1、細胞水平:Wistar大鼠主動脈平滑肌細胞分離培養(yǎng),應(yīng)用Zymography和Western blotting技術(shù)鑒定不同濃度梯度及時間梯度的Hcy對培養(yǎng)的平滑肌細胞

2、MMP-2蛋白表達和酶解活性的影響及不同濃度梯度和時間梯度的瑞舒伐他汀、肝素干預(yù)效果。
　　 2、動物水平:40只LDL受體基因敲除小鼠隨機分為5組,分別喂以普通飼料、普通飼料+高蛋氨酸(蛋氨酸組)、普通飼料+高蛋氨酸+高脂(對照組)、普通飼料+高蛋氨酸+高脂+肝素、普通飼料+高蛋氨酸+高脂+瑞舒伐他汀喂養(yǎng)3個月,實驗最終日處死動物,測定了血清Hcy水平、血脂水平；解剖心血管系統(tǒng),蘇丹Ⅳ染色觀察動脈粥樣硬化斑塊形成情況；主動脈竇

3、及主動脈弓部石蠟包埋切片,H&E染色觀察動脈粥樣硬化斑塊面積,免疫組織化學(xué)染色觀察動脈粥樣硬化斑塊處MMP-2表達情況,主動脈竇部和弓部蛋白提取物Zymography法檢測動脈粥樣硬化斑塊部位MMP-2的酶解活性。
　　 結(jié)果:
　　 一、細胞實驗:
　　 1、Zymography法檢測細胞培養(yǎng)上清液中MMP-2的活性
　　 ⅰ:Zymography分析發(fā)現(xiàn),藍色背景上的白色透明條帶分子量為72kDa,即

4、為MMP-2所在的條帶。用酶解明膠量表示MMP-2活性,Hcy在50～1000μmol/L時增強MMP-2的活性(P<0.01)；而Hcy在5000μmol/L時抑制MMP-2的活性(P<0.01)；相同濃度Hcy干預(yù)條件下,72h的作用明顯強于48h和24h(P<0.01)。
　　 ⅱ:肝素在7.5～750U/mL濃度下能抑制Hcy(1000μmol/L)對血管平滑肌細胞MMP-2活性的增強作用；相同濃度肝素干預(yù)條件下,72h

5、的抑制作用強于48h和24h(P<0.01)。
　　 ⅲ:瑞舒伐他汀在10-5～10-9mol/L濃度下能抑制Hcy(1000μmol/L)對血管平滑肌細胞MMP-2活性的增強作用；相同濃度瑞舒伐他汀干預(yù)條件下,72h的抑制作用強于48h和24h(P<0.01)。
　　 2、Western blotting法檢測細胞培養(yǎng)上清液中MMP-2的表達
　　 ⅰ:免疫印跡法檢測細胞培養(yǎng)上清液中蛋白,條帶分子量為72 kD

6、a,即為MMP-2。Hcy在50～5000μmol/L時能增強MMP-2的表達(P<0.01)；相同濃度Hcy干預(yù)條件下,72h的作用明顯強于48h和24h(P<0.01)。
　　 ⅱ:肝素在7.5～750U/mL濃度下能抑制Hcy(1000μmol/L)對血管平滑肌細胞MMP-2表達的增強作用；相同濃度肝素干預(yù)條件下,72h的抑制作用強于48h和24h(P<0.01)。
　　 ⅲ:瑞舒伐他汀在10-5～10-9mol/

7、L濃度下能抑制Hcy(1000μmol/L)對血管平滑肌細胞MMP-2表達的增強作用；相同濃度瑞舒伐他汀干預(yù)條件下,72h的抑制作用強于48h和24h(P<0.01)。
　　 二、動物實驗:
　　 1、血清Hcy水平測定:
　　 ①:標準飼料組血清Hcy水平較其余4組低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；
　　 ②:肝素組與對照組、及瑞舒伐他汀組與對照組之間無顯著性差異(P>0.05)。
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8、、血脂水平測定:
　　 ①:肝素組總膽固醇水平較對照組低且有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),高密度脂蛋白膽固醇較對照組高且有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；
　　 ②:瑞舒伐他汀組總膽固醇、總甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇水平較對照組低且有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；
　　 ③:蛋氨酸組血脂水平與標準飼料組之間無顯著性差異；
　　 ④:瑞舒伐他汀與對照組相比能顯著降低血漿OxLDL水平(P<0.05)。
　　

9、 3、Zymograph法檢測動脈粥樣硬化斑塊MMP-2的酶解活性:
　　 ①:肝素組和瑞舒伐他汀組MMP-2酶解活性與對照組相比均有顯著性差異(P<0.05)；
　　 ②:瑞舒伐他汀組對MMP-2酶解活性的抑制作用較肝素組高,2組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　 4、主動脈大體標本蘇丹Ⅳ染色動脈粥樣硬化斑塊面積分析:
　　 ①:肝素和瑞舒伐他汀均能顯著抑制LDL受體基因敲除小鼠主動脈粥樣硬化

10、斑塊的形成,與對照組之間差異有均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；
　　 ②:瑞舒伐他汀較肝素對LDL受體基因敲除小鼠主動脈粥樣硬化斑塊形成的抑制作用更為顯著,兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　 5、主動脈竇石蠟切片H&E染色動脈粥樣硬化面積分析:
　　 ①:肝素和瑞舒伐他汀均能抑制LDL受體基因敲除小鼠主動脈粥樣硬化的形成,與對照組之間差異有均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；
　　 ②:瑞舒伐他汀

11、較肝素對LDL受體基因敲除小鼠主動脈粥樣硬化斑塊形成的抑制作用更為顯著,兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　 6、主動脈竇石蠟切片MMP-2免疫組織化學(xué)染色分析:
　　 ①:肝素和瑞舒伐他汀均能抑制LDL受體基因敲除小鼠主動脈粥樣硬化斑塊處MMP-2的表達,與對照組之間差異有均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；
　　 ②:瑞舒伐他汀組與肝素組之間對LDL受體基因敲除小鼠主動脈粥樣硬化斑塊處MMP-2表達的抑