人天然免疫基因BCL10的豬同源物的識(shí)別、克隆與初步表達(dá)分析.pdf

1、先天性免疫是機(jī)體防御病原體感染的第一道防線，而B(niǎo)CL10(B cell lymophoma-10)是先天性免疫系統(tǒng)的一個(gè)重要功能基因。體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗(yàn)證實(shí)該蛋白具有激活NF-κB蛋白家族的信號(hào)傳導(dǎo)分子通路和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的活性。BCL10蛋白的正常生理水平表達(dá)可以通過(guò)激活NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)B細(xì)胞的發(fā)育成熟，從而促進(jìn)免疫因子的產(chǎn)生，增強(qiáng)機(jī)體的先天免疫和抵御細(xì)菌類病原體感染的能力；相反，BCL10蛋白的過(guò)量產(chǎn)生會(huì)促生一系列免疫抑制因子，可

2、能導(dǎo)致淋巴瘤等多種疾病的發(fā)生。為探討B(tài)CL10基因在豬體內(nèi)的功能，本研究結(jié)合生物信息學(xué)方法和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，依照人BCL10基因序列克隆到BCL10蛋白的豬體同源性基因，并對(duì)該基因編碼蛋白質(zhì)的功能進(jìn)行了系統(tǒng)的基因組學(xué)分析，同時(shí)對(duì)其表達(dá)規(guī)律和特點(diǎn)進(jìn)行了初探，獲得了以下結(jié)果。 1.根據(jù)基因存在論(Gene Ontology)與同源比對(duì)算法，以已獲得的人BCL10基因?yàn)榫€索，根據(jù)豬基因表達(dá)序列標(biāo)簽(Expressed sequence

3、 tag，EST)與豬基因組數(shù)據(jù)庫(kù)資料，電子克隆獲得了豬的同源基因。并對(duì)獲得的新基因進(jìn)行了開(kāi)放閱讀框(ORF)的尋找、全長(zhǎng)cDNA的識(shí)別及基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控基序分析。分子生物學(xué)試驗(yàn)驗(yàn)證了該基因的存在，其ORF共702個(gè)核苷酸，編碼233個(gè)氨基酸。序列5'端富含GC序列，最大ORF第一個(gè)起始密碼子為ATG，緊鄰ACC序列，具典型的Kozak序列，符合真核細(xì)胞RNA有效轉(zhuǎn)錄的需要。同時(shí)，將克隆到的新基因序列提交至GenBank進(jìn)行驗(yàn)證，獲得注冊(cè)號(hào)

4、：ELJ088132。 2.利用生物信息學(xué)方法對(duì)豬BCL10蛋白遺傳進(jìn)化特點(diǎn)及功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了系統(tǒng)的基因組學(xué)分析，推測(cè)其二級(jí)結(jié)構(gòu)以螺旋為主，不含有跨膜區(qū)，很可能是核內(nèi)蛋白。并將其定位于豬的4號(hào)染色體(chromosome 4)上，確定存在3個(gè)外顯子。其編碼的氨基酸含有一個(gè)CARD結(jié)構(gòu)域，從而推測(cè)其在細(xì)胞凋亡中扮演著重要角色。為對(duì)其功能的深入研究指明方向。 3.采用半定量PCR檢測(cè)了豬在正常情況下7個(gè)重要組織(心臟、腎臟、

5、脾臟、胸腺、大腦、肝臟和下頜淋巴結(jié)組織)中BCL10基因mRNA表達(dá)豐度，利用SPSS11.5軟件進(jìn)行單因素試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析與顯著性檢驗(yàn)。研究結(jié)果表明，BCL10基因mRNA在脾臟中表達(dá)最高，胸腺、大腦和下頜淋巴結(jié)表達(dá)次之，肝臟只有微量表達(dá)，腎臟沒(méi)有檢測(cè)到表達(dá)。初步掌握了該基因在豬體內(nèi)的表達(dá)特點(diǎn)。 4.將BCL10基因與高效的帶有綠色熒光標(biāo)記的真核表達(dá)載體pEGFP-C1相連，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pEGFP-BCL10。利用 Lipofe

6、ctamine 2000 Regent轉(zhuǎn)染pEGFP-BCL10和pEGFP-C1質(zhì)粒于PK-15細(xì)胞中，由最佳G418濃度抗性篩選在12 d后分別得到轉(zhuǎn)染pEGFP-BCL10與pEGFP-C1的陽(yáng)性細(xì)胞。顯微鏡下觀察到典型的帶有綠色熒光標(biāo)記的細(xì)胞形態(tài)，進(jìn)一步用RT-PCR方法驗(yàn)證BCL10基因得到了成功表達(dá)。同時(shí)，構(gòu)建了表達(dá)BCL10蛋白的原核表達(dá)載體pET-BCL10。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)宿主菌，用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)