抗Ⅳ型膠原抗體偶聯(lián)金雀異黃素抑制后發(fā)障的研究.pdf

1、本文研究目的：制備抗Ⅳ型膠原抗體-金雀異黃素偶聯(lián)物，檢測偶聯(lián)物抗體活性及藥物的活性，評價其對人晶狀體上皮細胞的抑制作用。為導向藥物治療在眼內(nèi)應(yīng)用提供理論依據(jù)。 研究方法： 第一部分：金雀異黃素抑制體外人晶狀體上皮細胞增殖的研究。 1、細胞培養(yǎng)凍存的人晶狀體上皮細胞復(fù)蘇后，用含10％的胎牛血清100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素及1.9g/LHEPES的DMEM培養(yǎng)基，37℃、5％CO<,2>的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)

2、，繪制細胞生長曲線。 2、MTT測定不同濃度組金雀異黃素不同時間對人晶狀體上皮細胞增殖的抑制作用。 3、流式細胞儀檢測不同濃度組金雀異黃素在24h、48h、72h對人晶狀體上皮細胞周期及凋亡的影響。 4、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測不同濃度組金雀異黃素作用人晶狀體上皮細胞48h后人晶狀體上皮細胞內(nèi)P21、P53、CyclinD1 mRNA表達情況。 5、免疫印跡(western blot)檢測不同濃度組金雀異黃

3、素作用人晶狀體上皮細胞48h后人晶狀體上皮細胞內(nèi)P21、P53、CyclinD1蛋白表達情況。 第二部分：抗Ⅳ型膠原抗體一金雀異黃素偶聯(lián)物制備提純及檢測。 1、抗Ⅳ型膠原抗體與金雀異黃素通過活性酯法偶聯(lián)。 2、抗Ⅳ型膠原抗體．金雀異黃素偶聯(lián)物的提純及檢測。 3、免疫組織化學實驗檢測偶聯(lián)物中抗體活性。 第三部分：抗Ⅳ型膠原抗體一金雀異黃素偶聯(lián)物體外抑制人晶狀體上皮細胞增殖的研究。 1、倒置顯

4、微鏡細胞形態(tài)學的觀察，偶聯(lián)物作用人晶狀體上皮細胞，觀察48h內(nèi)細胞形態(tài)變化，并拍攝細胞生長情況。 2、丫啶橙染色觀察細胞凋亡情況。 3、MTT法分析偶聯(lián)物作用人晶狀體上皮細胞12、24、48h對人晶狀體上皮細胞增殖抑制作用。 研究結(jié)果： 1、繪制了人晶狀體上皮細胞生長曲線，傳代后3-5天為對數(shù)生長期。 2、不同濃度的金雀異黃素可抑制LECs增殖，在0-75mg/L范圍內(nèi)呈劑量效應(yīng)關(guān)系，并隨時間的延

5、長，抑制效應(yīng)增強。質(zhì)量濃度為75 mg/L的金雀異黃素作用12 h對hLEC抑制作用與對照組差異有統(tǒng)計學意義(P=0.03)，作用24 h、48 h質(zhì)量濃度為12.5、25、50、75 mg/L的金雀異黃素對LEC抑制作用與對照組有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，72 h組各質(zhì)量濃度的金雀異黃素對LEC抑制作用與對照組均有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。 3、隨Gen濃度的增大，G<,1>-S期細胞明顯增多。金雀異黃素作用24 h誘導凋

6、亡不明顯；在48 h組，質(zhì)量濃度為12.5 mg/L處理組出現(xiàn)凋亡峰，當質(zhì)量濃度達到50.0 mg/L時凋亡明顯；處理72 h，6.25 mg/L質(zhì)量濃度組即可誘導凋亡，25mg/L質(zhì)量濃度組凋亡達51.83％，50 mg/L質(zhì)量濃度組凋亡達59.3％。 4、RT-PCR檢測結(jié)果顯示，隨Gen濃度逐漸增高，晶狀體上皮細胞P21mRNA的表達逐漸下調(diào)，而CyclinD<,1>的mRNA表達水平上調(diào)，而對照組及不同濃度Gen處理組p

7、53的mRNA均有表達，處理組與對照組間有統(tǒng)計學差異，但各處理組間無統(tǒng)計學差異。 5、Western blot法檢測結(jié)果：隨Gen作用濃度增加P21蛋白表達逐漸減少，CyclinD<,1>蛋白表達水平逐漸增高，P53蛋白表達處理組與對照組之間表達有顯著差異(P<0.05)，但各處理組間無顯著差異。 6、抗Ⅳ型膠原抗體與金雀異黃素通過活性酯法成功偶聯(lián)，本研究偶聯(lián)產(chǎn)物中抗Ⅳ型膠原抗體與金雀異黃素克分子比為1∶439，偶聯(lián)物與

8、晶狀體囊膜可特異結(jié)合。 7、丫啶橙染色觀察經(jīng)偶聯(lián)物作用24h、48h后的細胞均發(fā)生凋亡的形態(tài)學改變。 8、偶聯(lián)物作用人晶狀體上皮細胞12、24、48h對人晶狀體上皮細胞增殖均有抑制作用，抑制率分別為28.5％、50.3％和76.9％。 研究結(jié)論： 1、金雀異黃素能夠抑制人晶狀體上皮細胞的增殖，這種抑制是通過細胞周期阻滯和細胞凋亡共同作用的結(jié)果。 2、采用活性酯法可成功地將抗Ⅳ型膠原抗體與金雀異黃素