采用RNAi技術(shù)抑制Colo-16細(xì)胞EGFR表達(dá)及其誘導(dǎo)凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:構(gòu)建靶向EGFR短發(fā)夾RNA(shRNA)重組質(zhì)粒載體并轉(zhuǎn)染人皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株Colo-16細(xì)胞,觀察其轉(zhuǎn)染效率及對(duì)EGFR基因mRNA和蛋白表達(dá)的抑制效應(yīng),篩選出能高效且特異阻斷EGFR基因表達(dá)的重組質(zhì)粒載體。將此高效重組質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染Colo-16細(xì)胞,觀察Colo-16細(xì)胞對(duì)雷帕霉素敏感性的變化及Colo-16細(xì)胞凋亡的變化并探討其可能機(jī)制。
　　 方法:
　　 第一部分:靶向EGFR基因shRNA干擾載體

2、的構(gòu)建與鑒定根據(jù)RNA干擾原理,體外設(shè)計(jì)并合成4對(duì)靶向EGFR基因shRNA,即shRNA1、shRNA2、shRNA3、shRNA4;以pGPU6/GFP/Neo質(zhì)粒為載體,分別構(gòu)建pGPU6/GFP/Neo-EGFR-shRNA1、pGPU6/GFP/Neo-EGFR-shRNA2、pGPU6/GFP/Neo-EGFR-shRNA3、pGPU6/GFP/Neo-EGFR-shRNA4,轉(zhuǎn)化入JM109大腸桿菌,提取質(zhì)粒,進(jìn)行酶切和測(cè)

3、序鑒定;分別以Lipofectamine2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染皮膚鱗狀細(xì)胞癌Colo-16細(xì)胞,采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定轉(zhuǎn)染效率;收集轉(zhuǎn)染48小時(shí)后的Colo-16細(xì)胞提取總RNA和總蛋白,RT-PCR和Western blot技術(shù)分別檢測(cè)EGFR基因mRNA及蛋白表達(dá)水平,計(jì)算抑制率,篩選有效靶點(diǎn)。
　　 第二部分: EGFR-shRNA增強(qiáng)Colo-16細(xì)胞對(duì)雷帕霉素敏感性和誘導(dǎo)Colo-16細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究將篩選出的重組質(zhì)粒載體pG

4、PU6/GFP/Neo-EGFR-shRNA1轉(zhuǎn)染Colo-16細(xì)胞,采用四甲基偶氮唑藍(lán)法(MTT)測(cè)定Colo-16細(xì)胞對(duì)雷帕霉素敏感性的變化;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Colo-16細(xì)胞凋亡率,Hoeehst33258熒光染色觀察Colo-16細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變;Westem blot檢測(cè)EGFR、Akt、NF-κB的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果:
　　 第一部分:靶向EGFR基因shRNA干擾載體的構(gòu)建與鑒定酶切結(jié)果表明,所有質(zhì)粒均

5、為陽(yáng)性重組質(zhì)粒,測(cè)序的堿基序列與設(shè)計(jì)合成的堿基序列完全一致,證實(shí)shRNA能準(zhǔn)確完整地導(dǎo)入質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo。流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定重組質(zhì)粒對(duì)Colo-16細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率為38.28％。RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組相比,除pGPU6/GFP/Neo-EGFR-shRNA2對(duì)EGFR基因mRNA和蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯抑制作用以外,其它重組質(zhì)粒對(duì)EGFR基因mRNA和蛋白均有不同程度的抑制作用(p＜0.05

6、),其中pGPU6/GFP/Neo-EGFR-shRNA1的抑制作用最強(qiáng),對(duì)EGFR基因mRNA和蛋白抑制率分別為63.35％和55.5％。
　　 第二部分: EGFR-shRNA增強(qiáng)Colo-16細(xì)胞對(duì)雷帕霉素敏感性和誘導(dǎo)凋亡的實(shí)驗(yàn)研究pGPU6/GFP/Neo-EGFR-shRNAl重組質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染Colo.16細(xì)胞后,Colo-16細(xì)胞對(duì)雷帕霉素的敏感性提高了2.44倍,細(xì)胞凋亡率達(dá)(12.65±0.091)％,與空白組相

7、比,差異有顯著性(p＜0.05)。Hoechst33258熒光染色顯示Colo-16細(xì)胞核染色質(zhì)出現(xiàn)凝聚、邊集、核裂解等形態(tài)學(xué)改變。Western blot檢測(cè)表明轉(zhuǎn)染后Colo-16細(xì)胞EGFR、Akt、NF-κB的表達(dá)顯著下調(diào)。
　　 結(jié)論:本研究成功構(gòu)建并篩選出1個(gè)高效且特異阻斷EGFR基因表達(dá)的RNA干擾重組質(zhì)粒表達(dá)載體pGPU6/GFP/Neo-EGFR-shRNA1,對(duì)Colo-16細(xì)胞具有較高轉(zhuǎn)染效率。pGPU6/