COX-2AsODN對(duì)Colo-16細(xì)胞體外增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:通過觀察環(huán)氧合酶(COX-2)反義寡核苷酸（AsODN)對(duì)體外培養(yǎng)的人皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株Colo-16細(xì)胞體外增殖的抑制作用及誘導(dǎo)凋亡作用，初步探討COX-2AsODN抑制皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞生長(zhǎng)的可能機(jī)制，為COX-2 AsODN臨床治療皮膚鱗狀細(xì)胞癌提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。
　　 方法:人皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株Colo-16常規(guī)培養(yǎng)于含10％胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中，在

2、37℃、5％CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分陰性對(duì)照組、脂質(zhì)體組 (Lip)、COX-2無(wú)義寡核苷酸組（NsODN)、COX-2 AsODN組（400noml/L）。
　　 第一部分 COX-2AsODN對(duì)Colo-16細(xì)胞體外增殖和凋亡的影響:1.免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)Colo-16細(xì)胞中COX-2蛋白表達(dá)；2.免疫熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染情況；3.細(xì)胞增殖測(cè)定:①四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)COX-2 AsODN對(duì)Colo-16細(xì)

3、胞體外增殖的影響；②克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察COX-2AsODN對(duì)Colo-16細(xì)胞克隆形成能力的影響；4.細(xì)胞凋亡檢測(cè):①Hoechst33258熒光染色法觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化；②AnnexinV-FITC和PI雙染檢測(cè)Colo-16細(xì)胞凋亡率。
　　 第二部分 COX-2AsODN對(duì)Colo-16細(xì)胞COX-2、c-myc、VEGF表達(dá)的影響:1.半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法(RT-PCR)測(cè)定COX-2AsODN處理Colo-1

4、6細(xì)胞后COX-2mRNA的表達(dá)變化；2.免疫印跡法測(cè)定COX-2AsODN處理Colo-16細(xì)胞后COX-2、c-myc、VEGF蛋白表達(dá)水平；3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 結(jié)果:
　　 第一部分COX-2AsODN對(duì)Colo-16細(xì)胞體外增殖和凋亡的影響:1.Colo-16細(xì)胞中COX-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)，并分布在胞漿、胞核；2.在Colo-16細(xì)胞漿和細(xì)胞核可見熒光標(biāo)記的COX-2 NsODN、AsODN；3.增殖作用：①C

5、OX-2AsODN組轉(zhuǎn)染Colo-16細(xì)胞24h、48h、72h、96h后，細(xì)胞增殖受到顯著抑制，與陰性對(duì)照組、脂質(zhì)體組及COX-2NsODN組相比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且抑制作用在轉(zhuǎn)染后48h最明顯，抑制率可達(dá)60.3％；②COX-2AsODN作用于Colo-16細(xì)胞后，克隆形成能力受到抑制，細(xì)胞克隆形成率下降（59.3±7.1vs21.6±4.1）。4.凋亡作用：①Hoechst33258熒光染色法顯示COX-2AsODN轉(zhuǎn)染細(xì)胞2

6、4h后，可見細(xì)胞核染色質(zhì)凝聚、邊集、核裂解的形態(tài)學(xué)改變，而陰性對(duì)照組、脂質(zhì)體組和COX-2NsODN組無(wú)明顯變化；②FCM檢測(cè)結(jié)果顯示COX-2AsODN顯著增加Colo-16細(xì)胞的早期凋亡，凋亡率為12.7％±1.01％，與陰性對(duì)照組、脂質(zhì)體組、COX-2NsODN（早期凋亡率分別為0.85％±0.09％、0.907％±0.07％、0.93％±0.06％）比較，差異有顯著性。
　　 第二部分COX-2AsODN對(duì)Colo-16

7、細(xì)胞COX-2、c-myc、VEGF表達(dá)的影響:1.RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示COX-2AsODN作用Colo-16細(xì)胞48h后COX-2mRNA表達(dá)顯著下調(diào)。2.Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示COX-2AsODN作用Colo-16細(xì)胞48h后，COX-2、c-myc、VEGF蛋白表達(dá)顯著下調(diào)。
　　 結(jié)論:
　　 1.COX-2AsODN能夠顯著抑制皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株Colo-16增殖并誘導(dǎo)其凋亡。