RNAi抑制Smad4基因表達對豬卵巢顆粒細胞凋亡的影響.pdf

1、Smads蛋白家族是近年新發(fā)現的細胞內信號傳導蛋白，在轉化生長因子（transforming growth factor， TGF-β）超家族成員的信號轉導通路中具有重要的作用。Smad4作為Smad蛋白家族重要成員之一，是哺乳類中發(fā)現的唯一一種Co-Smad，被認為是TGF-β各成員信號傳遞必需的中心轉導分子。Smad4在TGF-β/Smad信號通路中發(fā)揮著關鍵作用，其表達缺失或者突變都會引起TGF-β/Smad信號轉導紊亂，從而對機

2、體組織或細胞產生重要影響。近年來研究發(fā)現小鼠卵巢中存在Smad4信號轉導途徑，TGF-β對卵泡的分化調節(jié)很有可能是通過Smad4信號途徑實現。
　　 本文利用RNAi技術沉默Smad4基因，探討其對豬卵巢顆粒細胞凋亡的影響。設計并合成靶向Smad4的小分子干擾RNA，在脂質體的介導下轉染豬卵巢顆粒細胞，熒光定量PCR檢測Smad4 mRNA表達情況；MTT（四甲基偶氮唑鹽）比色法分析檢測細胞活性；原位末端核苷酸標記法（TUNEL

3、）及Annexin V/PI雙染流式細胞儀檢測細胞凋亡情況；熒光定量PCR檢測Bcl-2，Bax的mRNA表達水平。
　　 1 Smad4-siRNA轉染豬卵巢顆粒細胞及其效率檢測
　　 根據豬Smad4基因序列設計小分子RNA，利用脂質體轉染豬卵巢顆粒細胞。熒光定量PCR檢測Smad4 mRNA表達水平，Smad4-siRNA轉染濃度為8pmoL，作用36h時，Smad4-siRNA抑制效果最好，siRNA實驗組較空白

4、對照組下降84％(p＜0.01).利用MTT比色法檢測干擾后顆粒細胞活性，結果顯示，siRNA實驗組細胞活性(0.27)顯著低于對照組(0.31)（p＜0.05），說明Smad4-siRNA轉染對卵巢顆粒細胞的增殖有明顯的抑制作用，推測RNAi抑制Smad4基因表達可能引起豬卵巢顆粒細胞凋亡。
　　 2 RNAi抑制Smad4表達對顆粒細胞凋亡的影響
　　 采用原位末端核苷酸標記法(TUNEL)和Annexin V/PI

5、流式細胞儀進行細胞凋亡情況分析。結果顯示，siRNA實驗組較對照組凋亡細胞明顯增多，Smad4基因表達被抑制后，細胞凋亡率(22.1％)顯著高于對照組(17.0％)(p＜0.05)。表明沉默Smad4基因可促進豬卵巢顆粒細胞凋亡。
　　 3 RNAi抑制Smad4表達對Bcl-2和Bax的影響
　　 采用熒光定量PCR法檢測凋亡相關基因Bcl-2以及Bax在顆粒細胞中相對表達水平。結果顯示，與空白組相比，siRNA實驗組