活性氧調(diào)控炎性細胞因子表達與高血壓心臟重構(gòu)的關(guān)系及辛伐他汀干預(yù)研究.pdf

1、研究背景及目的: 高血壓是心血管疾病最重要的危險因素，而心臟重構(gòu)是導(dǎo)致高血壓患者心血管事件發(fā)生率顯著增加的獨立危險因素，是心臟功能由代償向失代償轉(zhuǎn)化的重要病理表現(xiàn)。因此，心臟重構(gòu)的發(fā)病機制和防治研究已成為國內(nèi)外熱點研究課題。現(xiàn)已明確，神經(jīng)體液因素的異常激活是心臟重構(gòu)發(fā)生的重要機制，但在多種神經(jīng)體液因素阻斷治療已成為高血壓常規(guī)治療的今天，仍然無法阻遏心臟功能向失代償發(fā)展的最終趨勢，心力衰竭發(fā)病率仍然居高不下。目前，隨著對炎癥反應(yīng)在

2、多種心血管疾病發(fā)病機制中作用的認識，炎性細胞因子作為炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)，已經(jīng)成為與心血管疾病相關(guān)的另一類重要的神經(jīng)體液因素。大量研究表明，炎性細胞因子可通過誘導(dǎo)心肌細胞肥大、細胞凋亡、調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)的合成和降解等多種途徑參與心臟重構(gòu)的形成。此外，心肌內(nèi)多種組成細胞可以與炎癥細胞一樣合成炎性細胞因子，通過自分泌和旁分泌方式影響心肌組織的損傷、修復(fù)和結(jié)構(gòu)的改變。 本課題組以往研究顯示，他汀類藥物可抑制心肌細胞肥大以及心臟成纖維細胞增

3、殖和膠原合成；在自發(fā)性高血壓大鼠模型中也證實，辛伐他汀(Sim)可延緩心肌肥厚的發(fā)展。這些研究提示他汀類藥物可調(diào)控心臟重構(gòu)過程，但其分子機制仍不十分清楚。本課題動態(tài)觀察高血壓大鼠心肌組織炎性細胞因子表達特點及其與心臟重構(gòu)和心功能變化的關(guān)系；研究ROS在心肌組織和心肌細胞炎性細胞因子表達機制中的作用；初步探討Sim 對高血壓心臟重構(gòu)的防治作用及其分子機制。旨在炎癥介質(zhì)角度闡明高血壓心臟重構(gòu)的發(fā)病機制和他汀類藥物防治心臟重構(gòu)的分子機制。為高

4、血壓心臟重構(gòu)的防治提供新思路和理論依據(jù)。 研究方法:本研究先后以壓力負荷高血壓大鼠和體外培養(yǎng)的新生SD大鼠心肌細胞為實驗?zāi)Ｐ?，采用組織病理學(xué)分析、心臟超聲檢查、血流動力學(xué)分析、比色法、熒光探針技術(shù)、細胞色素C 還原試驗、ELISA、RT-PCR、Westernblot等方法和技術(shù)，動態(tài)觀察：(1) 壓力負荷大鼠心肌組織內(nèi)促炎因子TNF-α、IL-6 和抗炎因子IL-10 表達變化及其與心臟結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系；(2) 壓力負荷大鼠

5、對心肌組織ROS 水平及NADPH 氧化酶活性的影響；(3) 脂多糖（LPS）對心肌細胞內(nèi)ROS 水平、NADPH 氧化酶活性以及p38 MAPK 活性的影響；(4) 抗氧化劑氮乙酰半胱氨酸（NAC）干預(yù)對心臟重構(gòu)以及心肌組織和心肌細胞炎性細胞因子表達的影響；(5) Sim 干預(yù)對心臟重構(gòu)以及心肌組織和心肌細胞ROS 水平和炎性細胞因子表達的影響。 研究結(jié)果: (1) 腹主動脈縮窄（AC）組大鼠血壓在1周時就顯著高于假

6、手術(shù)（Sham）組，2周后左室重量指數(shù)（LVWI）、室壁厚度、心肌細胞內(nèi)徑、心肌組織膠原含量與Sham組比較明顯升高，4周后左室舒張功能降低，隨著觀察時間的延長，這些改變進行性發(fā)展。在8 周的觀察時間內(nèi)未發(fā)現(xiàn)左室收縮功能障礙。 (2) AC組大鼠心肌組織內(nèi)促炎因子TNF-α、IL-6以及抗炎因子IL-10 mRNA表達水平在2周后開始明顯升高，在4周時達到最高水平，分別比Sham組升高116％、183％、83％。 (

7、3) AC組大鼠心肌組織內(nèi)TNF-α、IL-6和IL-10蛋白表達水平在4周時明顯升高，分別比Sham組升高179％、114％和38％。而AC組和Sham組之間血清內(nèi)這些炎性細胞因子的蛋白表達水平無顯著性差異。 (4) 相關(guān)分析結(jié)果顯示，心肌組織TNF-α、IL-6蛋白表達水平與心肌膠原蛋白含量、左室舒張末期壓力均呈顯著正相關(guān)，而與心肌細胞內(nèi)徑無顯著相關(guān)性。心肌組織IL-10蛋白表達水平與膠原蛋白含量、LVEDP以及心肌細胞內(nèi)

8、徑均無明顯相關(guān)關(guān)系。 (5) AC組大鼠心肌組織ROS水平和NADPH氧化酶活性在1周時即顯著升高，與Sham組比較有非常顯著性差異。2周時達到最高水平，分別比Sham組升高140％和114％ ，4周和8周組ROS水平和NADPH氧化酶活性有所下降，但與對照組比較仍有非常顯著性差異。 (6) NAC治療后，壓力負荷大鼠LVWI、室壁厚度、膠原含量以及左室舒張功能均明顯改善，而血壓和心肌細胞內(nèi)徑無顯著變化。心肌組織TN

9、F-α、IL-6 mRNA和蛋白表達水平均明顯下降，與AC組比較有非常顯著性差異。而兩組之間IL-10 mRNA和蛋白表達水平無顯著性差異。 (7) 早期或晚期給予Sim治療后，壓力負荷大鼠血壓雖然無明顯變化，但LVWI、室壁厚度、膠原含量、心肌細胞內(nèi)徑以及左室舒張功能均明顯改善。而且Sim早期治療組對各指標的干預(yù)效果明顯優(yōu)于Sim晚期治療組。 (8) 早期或晚期給予Sim治療后，壓力負荷大鼠心肌組織TNF-α、IL

10、-6 mRNA和蛋白表達水平明顯下降，與AC組比較有顯著性差異，而且Sim早期治療組與Sim晚期治療組之間亦有顯著性差異，早期治療組TNF-α、IL-6表達水平下降得更為明顯。Sim治療對IL-10 mRNA和蛋白表達水平無顯著性影響。 (9) Sim治療后，壓力負荷大鼠心肌組織ROS水平和NADPH氧化酶活性明顯降低，而且與Sim晚期治療組比較，Sim早期治療組ROS水平和NADPH氧化酶活性下降得更為顯著。 (1

11、0) 在1μg/ml LPS作用下，體外培養(yǎng)的新生SD大鼠心肌細胞內(nèi)TNF-α、IL-6和IL-10mRNA和蛋白表達水平明顯增加，并具有時間依賴性，與對照組比較有顯著性差異。 (11) 在1μg/ml LPS作用下，心肌細胞ROS水平和NADPH氧化酶活性明顯升高，與對照組比較有非常顯著性差異。心肌細胞ROS水平和NADPH氧化酶活性的升高在時間上早于炎性細胞因子的表達。給予NAC或NADPH氧化酶抑制劑二亞苯基碘鎓預(yù)處理后

12、，心肌細胞TNF-α、IL-6蛋白表達水平較LPS組明顯降低，而IL-10蛋白含量與LPS組無顯著差異。 (12) 在20~500μmol/l外源性H2O2作用下，心肌細胞培養(yǎng)上清TNF-和IL-6蛋白含量與對照組比較均明顯升高，有顯著性差異。20~500 μmol/l H2O2對IL-10 蛋白含量無明顯影響。 (13)給予0.1~10μmol/l Sim預(yù)處理后再給予LPS刺激，TNF-α、IL-6 mRNA和蛋

13、白表達水平隨著Sim濃度的增加逐步下降，其中1μmol/l和10 μmol/l Sim干預(yù)組表達水平與LPS組比較有非常顯著性差異。而在1 μmol/l Sim的基礎(chǔ)上同時給予0.1 mmol/l 甲羥戊酸預(yù)處理，TNF-α、IL-6 mRNA和蛋白表達水平與1μmol/l Sim+LPS組比較顯著升高，而與LPS組比較無顯著性差異。0.1~10 μmol/l Sim對LPS誘導(dǎo)的IL-10 mRNA和蛋白表達水平無明顯影響。

14、 (14) 在1 μmol/l Sim預(yù)處理后再給予100 μmol/lH2O2刺激，心肌細胞培養(yǎng)上清TNF-α和IL-6 蛋白含量與H2O2組比較無顯著差異。 (15) 在1μg/ml LPS作用下，心肌細胞p38 MAPK 活性顯著增強，并且在時間上早于炎性細胞因子的表達。NAC、DPI以及Sim預(yù)處理可明顯抑制p38 MAPK活性，MVA可逆轉(zhuǎn)Sim對p38 MAPK 活性的抑制作用。 (16) 在LPS作用的

15、基礎(chǔ)上給予p38 MAPK抑制劑SB203580 預(yù)處理后，心肌細胞培養(yǎng)上清TNF-α、IL-6 蛋白含量明顯降低，與LPS組比較有非常顯著性差異，而IL-10蛋白含量與LPS組比較無顯著性差異。 研究結(jié)論: (1) 高血壓可上調(diào)心肌組織促炎性細胞因子表達，雖然與心臟重構(gòu)的啟動無關(guān)，但參與了心臟重構(gòu)的進一步發(fā)展，與間質(zhì)重構(gòu)和舒張性心臟功能衰竭相關(guān)。 (2) 高血壓可上調(diào)心肌組織ROS水平，ROS介導(dǎo)的信號通路

16、是心肌組織和心肌細胞內(nèi)促炎性細胞因子表達的重要機制之一，p38 MAPK可能是該信號通路的一個重要下游分子。抗氧化劑可以通過下調(diào)促炎性細胞因子表達延緩高血壓心臟重構(gòu)的進程。 (3) Sim可在一定程度上延緩和逆轉(zhuǎn)高血壓心臟重構(gòu)的發(fā)生，早期治療效果可能優(yōu)于晚期治療。 (4) Sim抑制心肌組織和心肌細胞NADPH 氧化酶活性，降低ROS水平，部分阻斷ROS信號通路，從而抑制促炎性細胞因子表達，可能是Sim延緩和逆轉(zhuǎn)心臟