活性氧介導(dǎo)大鼠肥厚心肌MCP-1的表達(dá)及其信號(hào)機(jī)制與辛伐他汀干預(yù)的研究.pdf

1、研究背景 目前認(rèn)為，心肌纖維化是高血壓左室肥厚的重要表現(xiàn)之一，其發(fā)病機(jī)制還不十分清楚。近來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)，在高血壓大鼠心肌中觀察到炎性細(xì)胞和成纖維細(xì)胞并存于纖維化區(qū)域，說(shuō)明炎癥參與了其病理過(guò)程。文獻(xiàn)報(bào)道，在心肌纖維化過(guò)程中炎性細(xì)胞尤其是單核細(xì)胞浸潤(rùn)是關(guān)鍵問(wèn)題，其中趨化因子起重要作用。單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)是CC型趨化蛋白的一種，對(duì)單核細(xì)胞有特異性趨化作

2、用，提示在壓力負(fù)荷大鼠心肌MCP-1的表達(dá)可能是心肌纖維化的機(jī)制之一。近來(lái)研究表明，活性氧(reactive oxygen species, ROS)可以調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、激活多種信號(hào)蛋白及調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)代謝，在心室肥厚和心衰中發(fā)揮重要作用。但是，在壓力負(fù)荷下ROS是否參與心肌纖維化，與MCP-1的表達(dá)有何關(guān)系目前尚不十分清楚。ROS可以激活多種氧化還原敏感的絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated prot

3、ein kinase, MAPKs）超家族成員，包括P38-MAPK、JNK1/2、ERK1/2等，但ROS具體通過(guò)哪條信號(hào)通路誘導(dǎo)MCP-1表達(dá)目前尚無(wú)報(bào)道。他汀類(lèi)藥物是3-羥-3-甲戊二酰輔酶A(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA，HMG-COA)還原酶抑制劑，近年研究發(fā)現(xiàn)他汀類(lèi)藥物有抗氧化、抗炎、抗纖維化等作用。但是它對(duì)壓力負(fù)荷大鼠ROS和MCP-1的作用如何目前也不十分清楚。 研究目的

4、本課題觀察壓力負(fù)荷大鼠氧化應(yīng)激水平和MCP-1表達(dá)的變化及其相關(guān)性；初步探討P38-MAPK、JNK1/2、ERK1/2信號(hào)途經(jīng)在其中所起的作用；同時(shí)研究辛伐他汀抗炎、抗氧化的可能機(jī)制，旨在闡明氧化應(yīng)激和炎癥在高血壓心肌纖維化中的作用，為防治高血壓和心肌纖維化提供新的理論依據(jù)和治療思路。 研究方法與內(nèi)容 本研究以腹主動(dòng)脈縮窄(abdominal aortic coarctation ，AC)大鼠為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，采用分光光度?jì)

5、、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）法、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）、蛋白免疫印記（Western blot）、免疫組化、計(jì)算機(jī)圖象分析等技術(shù)，動(dòng)態(tài)觀察：(1)AC對(duì)心肌纖維化的影響；(2)AC對(duì)大鼠心肌ROS、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、過(guò)氧化氫酶(CAT)等氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響；(3)AC對(duì)大鼠心肌MCP-1mRNA和蛋白表達(dá)及巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)的影響；(4)N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）阻

6、斷對(duì)氧化應(yīng)激指標(biāo)和MCP-1表達(dá)的影響；(5)P38-MAPK、JNK1/2、ERK1/2信號(hào)分子在ROS誘導(dǎo)MCP-1表達(dá)中的作用；(6)辛伐他汀對(duì)ROS和MCP-1表達(dá)的影響，及其對(duì)心肌重構(gòu)的逆轉(zhuǎn)作用。 研究結(jié)果 (1)AC術(shù)后1～4周均顯著升高大鼠平均動(dòng)脈壓（P<0.05）；AC術(shù)后2～4周顯著增加左室質(zhì)量分?jǐn)?shù)（LVW/BW）（P<0.05），但AC術(shù)后1周LVW/BW與假手術(shù)組（sham）比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

7、P>0.05）。 (2) AC引起心肌間質(zhì)纖維化和血管周?chē)睦w維化。AC術(shù)后2～4周的膠原容積分?jǐn)?shù)（collagen volume fraction，CVF），分別為3.28％±0.22％，5.38％±0.17％，7.09％±0.33％，各組與sham組（0.87％±0.19％）比較，均有非常顯著性差異（P<0.01）；1周組CVF為1.06％±0.17％，與sham組比較，差異不顯著（P>0.05）。AC術(shù)后2～4周組的血管周

8、圍膠原面積(perivascular collagen area，PVCA)分別為15.03％±0.88％，20.12％±1.01％，24.99％±0.91％，各組與sham組（6.19％±0.41％）比較，均有非常顯著性差異（P<0.01），1周組PVCA為9.02％±0.6％，與sham組比較，無(wú)顯著性差異（P>0.05）。 (3)ROS在AC術(shù)后1周明顯增加(30.43±1.50 U/mg pro)，2周達(dá)到高峰(42.2

9、7±1.33 U/mg pro)，3、4周稍有回落(34.91±1.60、32.33±1.36 U/mg pro)，但與sham組(17.29±1.78 U/mg pro)比較仍顯著增高(P<0.01)。NAC 1～4周組心肌ROS含量分別為12.12±0.75、11.76±0.67 、12.08±0.78、14.0±0.7 U/mg pro，與AC組各對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較，差異非常顯著(P<0.01)。 (4) AC術(shù)后1～4周心肌

10、SOD表達(dá)量分別為261.19±6.69、185.86±3.59、192.93±5.44 、217.37±3.10 U/mg pro， NAC 1～4周組SOD分別為369.92±8.04、342.80±7.32、352.48±9.95、358.19±7.07 U/mg pro。AC組較sham組各對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)均非常顯著升高；NAC組較AC組各對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)均非常顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。 (5) AC術(shù)后1～4周心

11、肌MDA 表達(dá)量分別為3.90±0.19、4.26 ±0.30、4.12±0.15、4.07±0.18 nmol/mg pro，NAC干預(yù)1～4周組分別為1.79±0.20、1.93±0.11、1.88±0.18、1.80±0.16 nmol/mg pro 。AC組均較sham組各對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)非常顯著升高；NAC組均較AC組各對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)非常顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。 (6) AC術(shù)后1～4周心肌CAT表達(dá)量分別為

12、7.36±0.86、5.80±0.91、6.49±0.63 、6.70±0.78 U/mg pro，NAC組1～4周分別為13.42±1.12、11.06±1.24、11.83±0.67、12.22±0.90 U/mg pro。AC組較sham組各對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)非常顯著降低；NAC組較AC組各對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)非常顯著升高（P<0.01）。 (7) AC術(shù)后ED1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)1周開(kāi)始增加(246±24)，2周達(dá)到高峰（582±33），3、4周

13、稍下降（512±30，386±26），與sham組各對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較，差異均非常顯著(P<0.01)。NAC1～4周組ED1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別為95±9、144±39、126±15、106±26，與AC組各對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較，差異均非常顯著(P<0.01)。 (8) AC術(shù)后1～4周心肌組織MCP-1蛋白水平表達(dá)量分別為66.95±4.53、84.79±5.92、43.10±3.11、辛伐他汀組（4.32％±0.23％、16.42％±0.

14、58％）與AC組比較，也有非常顯著性差異（P<0.01）。 (9)AC組大鼠ROS（32.33±1.36 U/mg pro）較sham組（17.44±1.92 U/mg pro）顯著升高（P<0.01），辛伐他汀組（13.9636.23±3.18 pg/mg pro，各組與sham組各對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)相比，均有非常顯著性差異(P<0.01)。NAC 1～4周組MCP-1蛋白表達(dá)量分別為21.34±3.02 、33.73±2.38 、2

15、2.3±2.76、19.35±2.82 pg/mg pro，與AC組各對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。 (10) AC術(shù)后1～4周MCP-1 mRNA水平分別為0.83±0.08、0.57±0.07、0.45±0.06、0.3±0.07，各組與sham組各對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較，均有非常顯著性差異(P<0.01)。NAC組1～4周MCP-1 mRNA水平分別為0.34±0.08、0.26±0.04、0.22±0.04、

16、0.21±0.04，各組與AC組各對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較，差異非常顯著（P<0.01）。 (11)AC組大鼠心肌P38-MAPK的磷酸化水平較sham組無(wú)明顯增加（P>0.05）， NAC干預(yù)后心肌P38-MAPK的磷酸化水平，與AC組比較也無(wú)顯著差別（P>0.05）。 (12)AC組大鼠心肌ERK1/2磷酸化水平明顯增高，ERK1/2活性較假手術(shù)組增加53％（P<0.01），NAC干預(yù)后ERK的磷酸化水平無(wú)明顯降低（150％±

17、10％ vs 153％±11％），無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。 研究結(jié)論 (1)AC可造成大鼠高血壓心肌纖維化的模型。(2)AC大鼠心肌ROS、MDA表達(dá)上調(diào)，抗氧化酶SOD、CAT表達(dá)下調(diào)，參與心肌纖維化發(fā)生、發(fā)展。(3)AC大鼠心肌MCP-1mRNA和蛋白表達(dá)量上調(diào)，提示兩者與心肌纖維化有關(guān)。(4)NAC干預(yù)后，可以顯著減輕氧化應(yīng)激水平和MCP-1mRNA及蛋白表達(dá)，說(shuō)明MCP-1的表達(dá)是ROS介導(dǎo)的。(5)JNK

18、1/2和ERK1/2參與了高血壓心肌纖維化，但ROS可上調(diào)大鼠心肌JNK1/2水平，但不影響P38-MAPK和ERK1/2的表達(dá)。(6)辛伐他汀可能通過(guò)抗氧化應(yīng)激和下調(diào)MCP-1表達(dá)，來(lái)改善心肌纖維化，達(dá)到逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)的目的。 綜上所述，壓力負(fù)荷大鼠心肌氧化應(yīng)激和炎癥參與了心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展。ROS介導(dǎo)MCP-1表達(dá)可能是通過(guò)MAPK信號(hào)通路中的JNK1/2起作用；辛伐他汀可以通過(guò)抑制ROS和MCP-1的表達(dá)來(lái)發(fā)揮逆轉(zhuǎn)心肌纖維