2-Cys Prx煙草遺傳轉(zhuǎn)化及其在鹽脅迫下的光破壞防御功能初探.pdf

1、逆境下光合作用介導(dǎo)的植物細(xì)胞內(nèi)會(huì)產(chǎn)生的氧自由基(ROS)，而ROS反過來會(huì)通過攻擊光合電予傳遞體、光合膜和PSⅡ等，導(dǎo)致植物光合機(jī)構(gòu)的破壞。因此，清除葉綠體內(nèi)的ROS特別是葉綠體內(nèi)膜的H2O2是保護(hù)逆境下植物光合機(jī)構(gòu)免受傷害的前提。在逆境脅迫下，葉綠體抗壞血酸氧化酶(APX)對ROS極為敏感，ROS會(huì)使APX鈍化失去活性。在APX鈍化時(shí)，雙半胱氨酸型硫氧還蛋白過氧化物酶(2-Cys Prx)在葉綠體中具有清除ROS的作用。2-Cys P

2、rx是新近在酵母菌中發(fā)現(xiàn)的一類硫氧還蛋白過氧化物酶(Prxs)，具有清除ROS的作用，高等植物葉綠體中存在2-Cys Prx，但是，在光破壞防御中的作用機(jī)制尚不清楚。本研究通過克隆煙草葉片2-Cys Prx基因，將其轉(zhuǎn)化到煙草中，利用2-Cys Prx基因過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株，研究2-Cys Prx在葉綠體中清除H2O2的功能，探索逆境下2-Cys Prx在光破壞防御中的調(diào)控機(jī)理，為植物抗逆生理學(xué)提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。
　　通過反轉(zhuǎn)

3、錄RT-PCR的方法從煙草品種“龍江911”葉片中克隆出2-Cys Prx基因的cDNA全長，其基因的大小為816 bp，包含了基因完整的編碼序列，且與已發(fā)表的基因序列相似度99.00％以上。利用表達(dá)載體prokⅡ與2-Cys Prx基因構(gòu)建了植物過表達(dá)載體，利用抑制表達(dá)載體pK7GWIWG2(Ⅱ)通過Gateway技術(shù)與2-Cys Prx基因構(gòu)建了植物抑制表達(dá)載體，之后導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404中，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將其轉(zhuǎn)入到煙草中，獲得

4、轉(zhuǎn)基因植株。經(jīng)基因組DNA的PCR和半定量RT-PCR的分子生物學(xué)檢測后，獲得過表達(dá)和抑制表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株。
　　以2-Cys Prx過表達(dá)轉(zhuǎn)基因煙草為材料進(jìn)行鹽脅迫處理，以野生煙草為對照，測定光合暗反應(yīng)活化前（調(diào)制式熒光）和暗反應(yīng)活化后（連續(xù)激發(fā)式熒光）PSⅡ光化學(xué)特性，驗(yàn)證2-Cys Prx在光破壞防御中的作用。結(jié)果顯示:鹽脅迫下，野生煙草APX活性明顯降低，H2O2含量升高，而2-Cys Prx過表達(dá)轉(zhuǎn)基因煙草葉片中H2O2含

5、量明顯低于野生煙草，說明2-Cys Prx在APX活性降低時(shí)可清除H2O2，減輕了鹽脅迫下的氧化傷害。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫下2-Cys Prx過表達(dá)轉(zhuǎn)基因煙草葉片PSⅡ原初光能轉(zhuǎn)化效率（Fv/Fm）降低幅度明顯低于野生煙草，而且葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度比野生煙草低，K點(diǎn)（照光后大約300μs處的特征位點(diǎn)）低于野生煙草，說明通過轉(zhuǎn)2-Cys Prx基因后，減輕了鹽脅迫下PSⅡ供體側(cè)的傷害程度。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，2-Cys Prx明顯增大了葉片PSⅡ受體側(cè)

6、的電子受體庫容量(Sm)，光合電子傳遞到電子傳遞鏈中超過QA-的電子受體的概率增加，減少了過多光能還原為QA，使QA的還原速率（Mo）減慢。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫下，2-Cys Prx過表達(dá)轉(zhuǎn)基因煙草葉片的非QA還原反應(yīng)中心和非QB還原反應(yīng)中心的比例下降程度高于野生煙草，說明2-Cys Prx在鹽脅迫下提高了有活性的PSⅡ反應(yīng)中心數(shù)量，將捕獲的光能用于光化學(xué)反應(yīng)，通過電子傳遞和耦聯(lián)的光合磷酸化形成同化力，推動(dòng)碳同化反應(yīng)，減輕了鹽脅迫對光合機(jī)構(gòu)

7、的傷害。
　　通過煙草2-Cys Prx基因的遺傳轉(zhuǎn)化研究，獲得過表達(dá)和抑制表達(dá)轉(zhuǎn)基因煙草，明確了2-Cys Prx作為抗氧化酶可清除ROS(H2O2)，并且在鹽脅迫下APX鈍化時(shí)，2-CysPrx發(fā)揮清除ROS作用，尤其是在鹽脅迫下，光合機(jī)構(gòu)發(fā)生光能過剩時(shí)，2-Cys Prx改變光合電子流的分配方向，減輕水裂解系統(tǒng)(OEC)和QA之前受體側(cè)部分被抑制的程度，增大PSⅡ受體側(cè)的電子受體庫容量，提高了有活性的PSⅡ反應(yīng)中心數(shù)量，減輕