采用定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選鼻咽癌轉(zhuǎn)移相關(guān)甲基化失活基因.pdf

1、目的:采用定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，從全景式角度篩選與鼻咽癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移相關(guān)的甲基化失活基因，為揭示鼻咽癌浸潤轉(zhuǎn)移機(jī)制、加強(qiáng)鼻咽癌的防治以及提高鼻咽癌患者的治療效果和生存率提供重要的理論依據(jù)和科學(xué)基礎(chǔ)。
　　 方法:首先采用MTT法和流式細(xì)胞術(shù)篩選去甲基化藥物5-aza-2’-dC作用于高轉(zhuǎn)移潛能鼻咽癌細(xì)胞5-8F的最佳作用濃度和最佳作用時間。采用iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對三種蛋白樣本（甲基化抑制劑處理的5-8F細(xì)胞，對照組未處理的

2、5-8F細(xì)胞和對照組6-10B細(xì)胞）進(jìn)行差異標(biāo)記，結(jié)合二維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析對標(biāo)記的蛋白樣本進(jìn)行分離鑒定，找出表達(dá)差異的蛋白質(zhì)。采用spss13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　 結(jié)果:通過MTT和流式細(xì)胞術(shù)得出，經(jīng)過不同濃度的5-aza-2’-dC（0、1、2、5、10μmol/L）處理5-8F細(xì)胞后，細(xì)胞生長曲線出現(xiàn)明顯抑制，細(xì)胞阻滯在S期和G2-M期。當(dāng)濃度為5μmol/L、作用5-8F細(xì)胞4天時，其對于細(xì)胞的增殖、細(xì)胞

3、周期的阻滯和細(xì)胞凋亡的效果最佳。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過質(zhì)譜分析總共得到49876個多肽片段，通過ProteinPilot軟件查詢了40496個蛋白，最終發(fā)現(xiàn)了7種差異蛋白。通過對5-8F細(xì)胞和6-10B細(xì)胞的相對蛋白量表達(dá)進(jìn)行分析目前共鑒定出7種差異蛋白，它們包括RCHY1蛋白、RNA結(jié)合蛋白27等，而且在5-8F細(xì)胞中的表達(dá)均降低。通過對5-aza-2’-dC處理組5-8F和未處理組5-8F細(xì)胞的相對蛋白量表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)血清蛋白、核孔蛋白Nup85

4、在甲基化抑制劑處理的5-8F細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，而RCHY1蛋白、RNA結(jié)合蛋白27等五種蛋白表達(dá)下調(diào)。
　　 結(jié)論:1.甲基化抑制劑5-aza-2’-dC具有抑制鼻咽癌細(xì)胞5-8F生長增殖，使細(xì)胞發(fā)生G2-M期和S期雙期阻滯并介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，并且具有一定的劑量依賴性。5-aza-2’-dC濃度5μmol/L、作用時間為4天時，其對于5-8F細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期的阻滯和細(xì)胞凋亡的效果最佳。
　　 2.采用iTRAQ技術(shù)對

5、甲基化抑制劑未處理組細(xì)胞5-8F和6-10B蛋白表達(dá)差異進(jìn)行鑒定，目前發(fā)現(xiàn)了RCHY1，RNA結(jié)合蛋白27等7個差異蛋白，它們均在5-8F細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)。結(jié)果表明多個蛋白表達(dá)量的變化參與了鼻咽癌的浸潤轉(zhuǎn)移機(jī)制。
　　 3.采用iTRAQ方法對甲基化抑制劑處理組5-8F和未處理組5-8F細(xì)胞的蛋白表達(dá)差異進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)在處理組5-8F細(xì)胞中RCHY1蛋白等五種蛋白表達(dá)下調(diào)。而在處理組5-8F細(xì)胞核孔蛋白Nup85在經(jīng)過甲基化抑制劑