RAS-siRNA阻斷RAS通路并抑制人食管鱗癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、食管癌是我國(guó)常見的惡性腫瘤，而我國(guó)是世界上食管癌的高發(fā)國(guó)家，也是目前世界上食管癌死亡率最高的國(guó)家之一，具有發(fā)病率高、發(fā)病隱匿、易轉(zhuǎn)移和死亡率高等特點(diǎn)，且發(fā)病年齡又有年輕化趨勢(shì)，目前臨床工作中對(duì)食管癌的治療仍是以外科手術(shù)、放化療為主要治療方法。而手術(shù)雖能很快地去除癌病灶，但臨床許多中晚期食管癌患者已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，失去了手術(shù)指征，且術(shù)后極易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，放化療雖然能在近期緩解患者癥狀，縮小病灶，但遠(yuǎn)期療效不理想，且不可避免的毒副作用使許多患者最

2、終死亡，因此尋找新的治療方法，改善食管癌患者臨床癥狀，提高生存質(zhì)量，延長(zhǎng)生存期，具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。
　　食管癌的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移是一個(gè)多基因調(diào)控、多因素作用、多階段步驟的復(fù)雜過程。研究表明，信號(hào)傳導(dǎo)通路(Ras/MEK(MAPKK)/MAPK及細(xì)胞周期蛋白(cyclin)被證實(shí)與腫瘤的增殖侵襲轉(zhuǎn)移有較為密切的關(guān)系，有關(guān)基因治療和信號(hào)通路的傳導(dǎo)及調(diào)控異常在腫瘤研究中的作用日益前沿，其中Ras癌基因與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系十分密切，

3、Ras蛋白在細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，其在Ras通路中作為一種開關(guān)蛋白，控制著增殖信號(hào)的傳導(dǎo)，Ras蛋白的“開”“關(guān)”狀態(tài)的轉(zhuǎn)換調(diào)節(jié)著細(xì)胞的生理功能和信號(hào)傳導(dǎo)，人類實(shí)體瘤中往往有Ras基因族的突變，Ras基因至少存在于30％的人類癌癥中，而Ras/MAPK信號(hào)通路中的MAPK是將Ras蛋白下傳的重要信號(hào)傳遞分子。Ras信號(hào)傳導(dǎo)通路包括:生長(zhǎng)因子受體(EGFR)→含有SH2結(jié)構(gòu)域的接頭蛋白(Grb2)→核苷酸釋放因子(SOS)→R

4、as蛋白→Raf(MAPKKK)→MEK(MAPKK)→絲/蘇蛋白激酶(MAPK)→轉(zhuǎn)錄因子→DNA合成。因此，從Ras到MAPK是有一組酶兼底物的蛋白分子組成的鏈狀信號(hào)傳導(dǎo)途徑，由MAPKKK、MAPKK、MAPK組成的激酶級(jí)聯(lián)系統(tǒng)，使Ras傳來的信號(hào)得以逐級(jí)放大和傳遞。MAPK被激活后，轉(zhuǎn)至細(xì)胞核內(nèi)，直接激活轉(zhuǎn)錄因子.該因子與myc基因旁的特異的DNA序列結(jié)合，從而啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。myc基因產(chǎn)物也是轉(zhuǎn)錄因子，它能激活其他基因，最終，這些信

5、號(hào)集中起來誘導(dǎo)D型Cyclin的表達(dá)和活性，D型Cyclin與Cyclin依賴性激酶(如CDK4和CDK6)形成復(fù)合體，該復(fù)合體的形成促使細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期。因此，Ras/MAPK通路在受體信號(hào)和G1期進(jìn)展之間起著關(guān)鍵作用。
　　細(xì)胞周期的進(jìn)程受細(xì)胞周期蛋白(cyclin)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制物(CDKI)等調(diào)控因子及其之間的相互作用來調(diào)節(jié)。這種調(diào)節(jié)是通過視網(wǎng)膜母細(xì)胞癌基因產(chǎn)物Rb蛋白來

6、實(shí)現(xiàn)的。Rb蛋白對(duì)細(xì)胞周期中最關(guān)鍵的調(diào)控點(diǎn)G1/S期、G2/M期起著“閘門”的作用，Rb蛋白的磷酸化和非磷酸化最終決定細(xì)胞周期的進(jìn)程。與細(xì)胞衰老有關(guān)的細(xì)胞周期調(diào)控信號(hào)因子及途徑較為復(fù)雜，如CDK復(fù)合體的正調(diào)控因子PI3K（磷脂酰肌醇3激酶）和MAPK（有絲分裂原活性激酶）以及負(fù)調(diào)控因子p16ink4a、p21waf1、p27kip1等。一些原癌基因Ras、JNK（c2junN端激酶）及MAPK/ERK（胞外信號(hào)調(diào)控激酶）等，正常表達(dá)可促

7、進(jìn)細(xì)胞周期，而當(dāng)超常表達(dá)時(shí)則可誘導(dǎo)CDKI的表達(dá)進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯。
　　近些年來，在對(duì)食管癌細(xì)胞Ras/MEK(MAPKK)/MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路的研究中，運(yùn)用siRNA沉默RAS基因，研究RAS/MAPK通路與細(xì)胞周期、細(xì)胞的增殖侵襲凋亡及食管癌的發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，至今在國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。為了探討Ras/MEK(MAPKK)/MAPK腫瘤信號(hào)傳導(dǎo)通路及RNA干擾技術(shù)對(duì)食管癌Ras、MAPK、cyclinD1的影響及在食管癌治療

8、中的應(yīng)用價(jià)值，本研究擬從組織學(xué)、細(xì)胞學(xué)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等方面，系統(tǒng)研究siRNA-Ras后，RAS/MAPK信號(hào)通路中RAS、MAPK及cyclinD1的表達(dá)變化及食管鱗癌細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移等生物學(xué)功能的變化，為臨床治療食管癌提供一定的研究依據(jù)。
　　第一部分RAS、mapk及cyclinD1在人食管鱗癌組織中的表達(dá)
　　方法：
　　1、將臨床收集的105例食管鱗癌組織石蠟切片，分為正常組、癌旁組、癌組織高、中、低分化組

9、、轉(zhuǎn)移、未轉(zhuǎn)移組及浸潤(rùn)程度深和淺組，用免疫組化方法，分別對(duì)組織中RAS、MAPK和cyclinD1蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。
　　2、采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，檢測(cè)人食管正常組、癌旁組、癌組織高、中、低分化組、轉(zhuǎn)移、未轉(zhuǎn)移組及浸潤(rùn)程度深和淺組組織中RAS、MAPK和cyclinD1mRNA的相對(duì)表達(dá)量，評(píng)價(jià)三者的表達(dá)趨勢(shì)和相互關(guān)聯(lián)性。
　　3、以westernblot檢測(cè)人食管正常組、癌旁組、癌組織高、中、低分化組、轉(zhuǎn)移、未轉(zhuǎn)移

10、組及浸潤(rùn)程度深和淺組組織中RAS、MAPK和cyclinD1的相對(duì)表達(dá)量，評(píng)價(jià)三者的表達(dá)趨勢(shì)和相互關(guān)聯(lián)性。
　　結(jié)果：
　　1、RAS、MAPK和cyclinD1在食管鱗癌正常組織、癌旁組織、癌組織中均有不同表達(dá)，在正常組織中的陽性表達(dá)率為分別為19.0％、24.8％、26.7％，癌旁組織中的陽性表達(dá)率分別為46.7％、44.8％、50.5％，在癌組織中的陽性表達(dá)率分別為78.1％、80.9％、75.2％，癌組織組與正常組相

11、比有顯著性差異(P＜0.05)，而正常組織與癌旁組織間無顯著性差異(P＞0.05)。
　　2、RAS、MAPK和cyclinD1分別在食管鱗癌組織高、中、低分化組中的陽性表達(dá)P值分別為0.162、0.446、0.233，均P＞0.05，相互間比較均無顯著性差異。
　　3、RAS、MAPK和cyclinD1分別在食管鱗癌組織有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組間表達(dá)的P值為0.036、0.205、0.033，表明RAS、cyclinD1在食管鱗癌

12、組織有無轉(zhuǎn)移組間比較有顯著性差異(P＜0.05)，而MAPK在食管鱗癌組織有無轉(zhuǎn)移組間比較無顯著性差異P＞0.05。
　　4、RAS、MAPK和cyclinD1分別在食管鱗癌組織浸潤(rùn)深和浸潤(rùn)淺組間比較的P值分別為0.229、0.227、0.301，表明在食管癌細(xì)胞浸潤(rùn)深淺之間無明顯差異。
　　第二部分Ras-RNAi體外阻斷RAS通路及抑制食管癌EC9706細(xì)胞系的實(shí)驗(yàn)研究
　　第一章EC9706細(xì)胞中RassiRNA

13、的篩選與鑒定
　　方法：
　　1、設(shè)計(jì)三條siRNA前體片段（siK-ras-1，siK-ras-2，siK-ras-3），設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)的shRNA片段，分別與載體psilencer2.1-u6neo相連，得到pSilencer-siK-ras-1,pSilencer-siK-ras-2,pSilencer-siK-ras-3。BamHⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定篩選出正確重組子的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染EC9706細(xì)胞，評(píng)價(jià)干擾能力，篩選干擾效

14、率最高的片段，用于下游實(shí)驗(yàn)。
　　2.轉(zhuǎn)染人食管癌EC9706細(xì)胞株，熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染的表達(dá)，確定最佳轉(zhuǎn)染效率。
　　3.轉(zhuǎn)染48h后，提取RNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)pSilencer/siR-Ras表達(dá)載體對(duì)Ras表達(dá)水平的影響。
　　4.轉(zhuǎn)染72h后，收集細(xì)胞，Westernblot檢測(cè)pSilencer/siR-Ras表達(dá)載體對(duì)Ras表達(dá)水平的影響。
　　結(jié)果：
　　1.酶切鑒定及測(cè)序顯示pSi

15、lencer/siR-Ras表達(dá)載體構(gòu)建成功;
　　2.轉(zhuǎn)染EC9706細(xì)胞48h后，轉(zhuǎn)染效率達(dá)到80％以上;
　　3.轉(zhuǎn)染48h后，提取轉(zhuǎn)染后EC9706細(xì)胞中的總RNA和總蛋白，并進(jìn)行real-time和westernblot檢測(cè)，結(jié)果顯示三組細(xì)胞的ras基因表達(dá)均受到不同程度抑制，其中以pSilencer-siK-ras-2抑制最為明顯，抑制效率達(dá)到80±5％（P＜0.05）。
　　第二章Ras-RNAi抑制食管

16、癌EC9706細(xì)胞的生長(zhǎng)并增強(qiáng)化療敏感性的研究
　　方法：
　　將食管癌細(xì)胞系分為六組:①細(xì)胞組（不轉(zhuǎn)染）;②陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染空載體組）;③實(shí)驗(yàn)組（轉(zhuǎn)染Ras-RNAi組）;④細(xì)胞加紫杉醇組;⑤陰性對(duì)照（轉(zhuǎn)染空載體組）加紫杉醇組;⑥轉(zhuǎn)染Ras-RNAi加紫杉醇組。
　　1、以MTT法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞活性及對(duì)紫杉醇的敏感性的變化;
　　2、以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖指數(shù)，觀察Ras基因表達(dá)抑制后對(duì)細(xì)胞周期的影

17、響;
　　3.以TUNEL法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡情況，觀察Ras基因表達(dá)抑制后對(duì)細(xì)胞凋亡的影響;
　　4、以免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組RAS、MAPK和cyclinD1蛋白表達(dá)情況;
　　5、實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組RAS、MAPK和cyclinD1表達(dá)情況，觀察Ras基因表達(dá)抑制后三種基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的變化;
　　6、以Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞細(xì)胞遷移數(shù)，觀察體外侵襲能力的變化;<

18、br>　　7、Westernblot法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組RAS、MAPK和cyclinD1蛋白表達(dá)情況，觀察RAS基因表達(dá)抑制后三種蛋白相對(duì)表達(dá)量的變化。
　　結(jié)果：
　　1、MTT檢測(cè)結(jié)果:Ras表達(dá)被抑制后，細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯受抑制，實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于細(xì)胞組和陰性對(duì)照組組明顯降低(P＜0.05);紫杉醇聯(lián)合Ras-siRNA后，細(xì)胞抑制更明顯，轉(zhuǎn)染Ras-RNAi加紫杉醇組相對(duì)于細(xì)胞加紫杉醇組和陰性對(duì)照加紫杉醇組明顯降低(P＜0.05

19、)。
　　2、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果:細(xì)胞周期亦發(fā)生了變化，共檢測(cè)了55次，處于G1/G0期的細(xì)胞比例增多，處于S或G2期的則減少，實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于細(xì)胞組和陰性對(duì)照組組更明顯(P＜0.05);轉(zhuǎn)染RASsiRNA組或加入紫杉醇后細(xì)胞阻滯于G1期，同時(shí)加入紫杉醇和Ras-siRNA后，阻滯于G1期更明顯一些（P＜0.05）。
　　3、TUNEL法檢測(cè)結(jié)果:轉(zhuǎn)染psilencer-Ras后，相對(duì)于細(xì)胞組和陰性對(duì)照組，轉(zhuǎn)染RASsiRNA

20、組及紫杉醇組凋亡增加，而轉(zhuǎn)染RASsiRNA組加入紫杉醇后細(xì)胞凋亡則更加明顯（P＜0.05），其細(xì)胞凋亡率明顯高于其他組;
　　4、Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果:轉(zhuǎn)染psilencer-Ras后，相對(duì)于陰性對(duì)照組和細(xì)胞組，轉(zhuǎn)染RASsiRNA組或紫杉醇組的侵襲能力下降，而轉(zhuǎn)染RASsiRNA組加入紫杉醇后則下降更為明顯(P＜0.05);
　　5、細(xì)胞化學(xué)及PCR結(jié)果:相對(duì)于細(xì)胞組和陰性對(duì)照組，轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染加

21、紫杉醇組中RAS、MAPK和cyclinD1蛋白的表達(dá)減少明顯(P＜0.05)，且呈遞減趨勢(shì);而RAS基因表達(dá)抑制后，MAPK和cyclinD1mRNA的相對(duì)表達(dá)量在各組中逐漸減少，而尤以轉(zhuǎn)染加紫杉醇組中的表達(dá)最低(P＜0.05)。
　　第三部分Ras-RNAi阻斷裸鼠食管癌移植瘤Ras信號(hào)通路活性及抑制其生長(zhǎng)的研究
　　方法：
　　1.建立人食管癌異種移植瘤實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，進(jìn)行人食管癌WC9706細(xì)胞株在裸鼠體內(nèi)的成瘤

22、實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞濃度為2×107/ml，在每只鼠背部皮下注射0.2ml（細(xì)胞數(shù)為2×106/ml）。約一周后，接種部長(zhǎng)出約米粒大小硬結(jié)，隨機(jī)分為6個(gè)實(shí)驗(yàn)組:①空白cell組;②control-siRNA組;③Ras-siRNA組;④紫杉醇組;⑤Ras-siRNA+紫杉醇組，每組8只裸鼠，均采用瘤旁注射的方式，每日一次，共15次，觀察裸鼠及移植瘤的生長(zhǎng)狀態(tài)。
　　2.以HE染色法觀察裸鼠體內(nèi)人食管癌抑制瘤治療前后的組織學(xué)形態(tài)。
　　

23、3.TUNEL法檢測(cè)治療前后各組的生長(zhǎng)抑制情況。
　　4.以免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組RAS、MAPK和cyclinD1蛋白表達(dá)情況，觀察裸鼠體內(nèi)人食管癌移植瘤治療前后三種蛋白的表達(dá)變化。
　　5.Westernblot法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組RAS、MAPK和cyclinD1蛋白表達(dá)情況，觀察觀察裸鼠體內(nèi)人食管癌移植瘤治療前后三種蛋白相對(duì)表達(dá)量的變化。
　　6.實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組RAS、MAPK和cyclinD1

24、mRNA表達(dá)情況，觀察裸鼠體內(nèi)人食管癌移植瘤治療前后三種基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的變化。
　　結(jié)果：
　　1.各組裸鼠在治療前抑制瘤的體積經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析無顯著性差異(P＞0.05)，處理后各組裸鼠抑制瘤的體積與細(xì)胞組比較明顯縮?。≒＜0.05），組織學(xué)觀察治療前細(xì)胞較大，染色較多，大小不一，異型性明顯;治療后抑制瘤細(xì)胞縮小，異型性不明顯，核染色稀疏，中心有點(diǎn)片狀壞死灶等，在RAS-siRNA組、紫杉醇組和RAS-siRNA+紫杉

25、醇組逐漸增大。
　　2、TUNEL法檢測(cè)結(jié)果表明:相對(duì)于細(xì)胞組，陰性對(duì)照組和RAS-siRNA組的細(xì)胞凋亡數(shù)均升高，而RAS-siRNA組的凋亡數(shù)明顯高于細(xì)胞組(P＜0.05);紫杉醇+RAS-siRNA組的凋亡數(shù)也明顯高于紫杉醇組和RAS-siRNA組（P＜0.05），但紫杉醇組與RAS-siRNA組的凋亡數(shù)比較無顯著性差異（P＜0.05）。
　　3、治療后，RAS、MAPK和cyclinD1蛋白在六組中的表達(dá)呈逐漸減少趨

26、勢(shì)，相對(duì)于細(xì)胞組和陰性對(duì)照組，轉(zhuǎn)染組的減少較明顯（P＞0.05）;在加入紫杉醇后，紫杉醇+RAS-siRNA組的表達(dá)明顯低于單純紫杉醇組和陰性對(duì)照+紫杉醇組(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1、通過檢測(cè)食管癌EC9706細(xì)胞系中RAS信號(hào)通路的活性，從蛋白水平、DNA結(jié)合水平及mRNA水平等證實(shí)了食管癌中存在著RAS信號(hào)通路及RAS-siRNA對(duì)通路的阻斷作用;
　　2、食管癌組織與正常組織中RAS蛋白、MAPK蛋白

27、和cyclinD1mRNA的表達(dá)有差異，同時(shí)RAS通路的活性變化及三者的高表達(dá)與食管癌的進(jìn)展、轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)與侵襲均密切相關(guān);
　　3、運(yùn)用RNA干擾技術(shù)阻斷體內(nèi)外RAS信號(hào)通路的活性，能夠降低細(xì)胞活性，使食管癌細(xì)胞的細(xì)胞周期停滯、腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖、阻止侵襲;
　　4、RAS-siRNA能使食管癌細(xì)胞中RAS通路下游基因MAPK及cyclinD1的表達(dá)顯著下降，RAS-siRNA對(duì)食管癌細(xì)胞一系列的抑制作用可能部分是通