重組人p53腺病毒注射液聯(lián)合放射治療對人淋巴瘤療效的實驗研究.pdf

1、目的： 采用重組人p53腺病毒注射液（recombinant adenovirus encoding human p53tumor suppressor gene，rAd—p53注射液，商品名今又生）聯(lián)合放射治療對淋巴瘤進行體外和體內治療實驗，以探討該藥物對淋巴瘤的治療效果和是否具有輻射增敏性。 方法： 1.設立對照組和實驗組，通過流式細胞術觀察Raji細胞和Daudi細胞的平均熒光強度，并計算其熒光指數(shù)FI（f

2、luorescence index），檢測人淋巴瘤細胞株Raji和Daudi的膜表面柯薩奇腺病毒受體（Coxsackie—adenoviral receptor，CAR）和整合素受體（integrin receptors，avβ3、avβ5）的表達。 2.采用四氮唑鹽比色法（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）測定按比例稀釋成不同濃度的rAd—p53注射液在給藥后24、48和72h對人淋巴瘤細胞株R

3、aji和Daudi抑制率，以確定藥物的最佳劑量和最佳作用時間點。檢測不同照射劑量的放射治療以及其聯(lián)合最佳藥物劑量對人淋巴瘤細胞株Raji和Daudi抑制率，以確定一個固定的放射治療劑量。通過倒置顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察細胞的形態(tài)學改變和細胞凋亡的形態(tài)學特征，來檢測rAd—p53注射液對細胞的抑制效果。用流式細胞術檢測細胞的周期變化以及細胞凋亡率，用RT—PCR檢測細胞的野生型p53基因mRNA的表達變化及其下游基因bcl—2和bax

4、的mRNA表達的改變，用蛋白質的western免疫印跡法（western—blotting）觀察細胞內P53蛋白的變化等。通過不同指標比較rAd—p53注射液、不同照射劑量的放射治療以及兩者聯(lián)合治療對Raji和Daudi人淋巴瘤細胞的作用效果。 3.建立人淋巴瘤細胞株Raji和Daudi裸鼠移植瘤模型，觀察腫瘤生長情況，其中荷Raji細胞裸鼠模型5只，荷Daudi細胞裸鼠模型4只，當腫瘤直徑達0.5cm時給予rAd—p53注射液

5、治療。初步觀察rAd—p53注射液的對腫瘤的生長抑制作用和荷瘤鼠的生存期。 結果： 1.Raji細胞和Daudi細胞膜表面的CAR受體和avβ3受體的FI>1，受體為陽性表達，而avβ5的受體為陰性表達，F(xiàn)I<1。 2.MTT檢測結果表明，人淋巴瘤細胞株Raji和Daudi的抑制率對rAd—p53注射液具有劑量和時間依賴性，，rAd—p53注射液劑量為2000vp/cell時對細胞的抑制率趨于最大，最佳rAd—p

6、53注射液劑量為2000vp/cell，最佳時間點為48h，達到的最大抑制率分別為（27.5±4.1）%和（28.1±1.6）%；兩種細胞對放射治療也具有劑量依賴性，細胞抑制率隨劑量升高；聯(lián)合治療為2000vp/cell的rAd—p53注射液劑量和6Gy的照射劑量聯(lián)合。 3.在倒置顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡下觀察的結果顯示，與陰性對照組比較，rAd—p53注射液作用后的人淋巴瘤細胞株Raji和Daudi的細胞形態(tài)未見明顯變化；放射

7、治療和聯(lián)合治療后，細胞形態(tài)較陰性對照組有明顯的差別，但放射治療加與不加rAd—p53注射液差別不明顯。 4.流式細胞術檢測的細胞周期變化和細胞凋亡率統(tǒng)計結果表明rAd—p53注射液對細胞周期未產(chǎn)生明顯的阻滯作用，也未見細胞凋亡率的增加；放射治療和聯(lián)合治療對細胞產(chǎn)生周期阻滯，Raji細胞阻滯于G2—M期，Daudi細胞阻滯于G0—G1期，細胞凋亡率明顯增高，分別為（35.6±1.7）%、（37.9±1.3）%和（31.1±2.4）

8、%、（31.5±2.0）%，但兩株細胞的放射治療和聯(lián)合治療的凋亡率比較未見明顯差異（P≥0.05）。 5. RT—PCR反應結果顯示，rAd—p53注射液和放射治療、聯(lián)合治療均使野生型p53基因及bax基因的mRNA的表達均較陰性對照組有所增強；Raji細胞bcl—2基因的mRNA表達未見明顯改變，Daudi細胞bcl—2基因為陰性表達。Western—blotting檢測結果顯示，rAd—p53注射液轉染和放射治療、聯(lián)合治療后

9、，人淋巴瘤細胞株Raji和Daudi的P53蛋白表達均有所增加。 6.荷人淋巴瘤裸鼠模型在給予藥物治療后，腫瘤體積依然隨時間的延長而增大，最終荷瘤模型均死于腫瘤引起的惡液質。荷Raji細胞裸鼠模型最長生存期為37d；荷Daudi細胞裸鼠模型最短生存期為22d。 結論： 1.Raji細胞和Daudi細胞膜表面的CAR受體和avβ3受體表達為陽性，多數(shù)學者認為腺病毒載體是可以轉染進入Raji細胞和Daudi細胞內。

10、 2.rAd—p53注射液雖然對淋巴瘤細胞株Raji和Daudi可產(chǎn)生一定的抑制作用，并可使野生型p53基因表達增強，并激活其下游抑癌基因bax表達增強，而且外源性P53蛋白的表達也增加，但轉染入細胞內的外源性p53基因的功能并沒有得到有效的發(fā)揮，因此未引起細胞形態(tài)和細胞凋亡形態(tài)學發(fā)生改變，也不能引起細胞周期的阻滯和細胞凋亡率的增加。說明該藥物對Raji細胞和Daudi細胞具有一定的轉染性，并可引起細胞分子生物學水平的表達，但其抑