重組腺病毒攜帶p53聯(lián)合抗癌藥物對間皮瘤的抗腫瘤效果研究.pdf

1、目的:惡性胸膜間皮瘤(malignant pleural mesothelioma,MPM)是一種源于胸膜間皮細胞、以局部侵襲為主、惡性度較高的罕見疾病。大多數(shù)惡性間皮瘤由石棉類物質(zhì)的過多接觸引起。盡管現(xiàn)在有很多治療手段,但仍然是一個棘手的病癥。它的潛伏期很長,目前也沒有可行的預(yù)防手段。未來數(shù)十年中,在很多工業(yè)化國家及新興發(fā)展中國家中病人的數(shù)量會持續(xù)攀升。胸膜切除術(shù)是一個僅適用于早期患者的治療選擇,但根治術(shù)后仍經(jīng)常復(fù)發(fā)。間皮瘤對放射治療

2、拮抗,因此僅在姑息療法時使用。因此對大多數(shù)患者來說化學(xué)療法是首選,聯(lián)合使用順鉑(CDDP)和培美曲塞(PEM)是目前一線的治療方案。然而,聯(lián)合順鉑和培美曲塞的治療方案平均生存期僅為12.1個月,且預(yù)后差。因此需要有一個新的治療方案來提高病人的預(yù)后和生活質(zhì)量。
　　 大多數(shù)惡性間皮瘤含有野生型P53基因,但p14ARF、p16INK4A基因缺陷。本實驗通過強制表達p53(Ad-p53):以腺病毒為載體,p53為治療基因,檢測是否會

3、抑制間皮瘤細胞的生長,以及Ad-p53與順鉑或培美曲塞聯(lián)用是否產(chǎn)生抗腫瘤效果。結(jié)果顯示Ad-p53進行間皮瘤轉(zhuǎn)導(dǎo),誘導(dǎo)P53磷酸化,從而上調(diào)p21和下調(diào)phos-Rb表達水平,并引起細胞凋亡蛋白酶8(caspase-8)和3(caspase-3)的剪切,從而引起癌細胞凋亡;細胞周期分析顯示出增加的G0/G1期比例以及sub-G1期比例,主要取決于細胞類型和Ad-p53的劑量;體外實驗Ad-p53轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制了間皮瘤細胞活性并以協(xié)同的方式,增

4、強了順鉑或培美曲塞的抑制效應(yīng);胸腔內(nèi)注射Ad-p53和順鉑全身給藥在原位動物模型產(chǎn)生出抗腫瘤效果。這些數(shù)據(jù)共同表明腺病毒攜帶P53基因(Ad-p53)是一種可以與一線藥物聯(lián)合治療間皮瘤的方法。
　　 方法:
　　 本研究選用人體間皮瘤細胞系,NCI-H2452,NCI-H2052,NCI-H226,NCI-Ft28及MSTO-211H。通過MTT實驗,檢測Ad-p53的轉(zhuǎn)導(dǎo)對此5種間皮瘤細胞系的增殖抑制效果。使用流式細胞

5、周期分析方法檢測Ad-p53對細胞周期變化的影響。以Western blot方法研究Ad-p53轉(zhuǎn)導(dǎo)引起的細胞凋亡傳導(dǎo)通路。MTT實驗,檢測Ad-p53和CDDP或PEM聯(lián)合用藥產(chǎn)生協(xié)同的癌細胞抑制作用。最后又運用動物體內(nèi)實驗,檢測Ad-p53和CDDP的聯(lián)合抗腫瘤效果。
　　 結(jié)果:
　　 1：MTT分析結(jié)果
　　 Ad-p53基因治療,除了NCI-H2052細胞外,以劑量依賴方式抑制了NCI-H28、NCI-

6、H2452、NCI-H226和MSTO-211H間皮瘤細胞的生長,而對照組Ad-LacZ則未抑制間皮瘤細胞的生長。50％抑制濃度值(IC50)顯示NCI-H28細胞對Ad-p53最敏感,隨后是NCI-H2452細胞,而NCI-H226和MSTO-211H細胞敏感程度相似。NCI-H2052細胞對Ad-p53不敏感,部分原因可能是Ad受體的低表達水平。
　　 2：流式細胞周期分析結(jié)果
　　 Ad-p53感染間皮瘤細胞系MS

7、TO-211H和NCI-H28。Ad-p53誘導(dǎo)了MSTO-211H細胞G0/G1期的靜止和sub-G1的增加;而Ad-p53感染NCI-H28細胞后顯現(xiàn)出G2/M期比例增加,S期比例下降,及明顯的sub-G1的增加。與MSTO-211H細胞相比,NCI-H28細胞的sub-G1增加的更為顯著,顯示出NCI-H28細胞對Ad-p53介導(dǎo)的細胞凋亡具有更高的敏感性。
　　 3：蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果
　　 3.1：蛋白質(zhì)印跡分

8、析法檢測了在MESO-211H和NCI-H28細胞中Ad-p53介導(dǎo)的分子傳導(dǎo)通路。Ad-p53誘導(dǎo)P53磷酸化及P21表達水平的增加。Phos-Rb的下調(diào),相當(dāng)于從磷酸化狀態(tài)到非磷酸化狀態(tài)的轉(zhuǎn)換。以上數(shù)據(jù)共同表明Ad-p53激活了p53介導(dǎo)的分子傳導(dǎo)通路;
　　 3.2：在MSTO-211H和NIC-H28兩個細胞系中,Ad-p53轉(zhuǎn)導(dǎo)后誘發(fā)了caspase-3和caspase-8的剪切,卻沒有誘導(dǎo)caspase-9的剪切。B

9、id表達水平保持不變,t-Bid在兩種細胞中均未檢測到。這些數(shù)據(jù)共同表明Ad-p53轉(zhuǎn)導(dǎo)通過caspase-8激活了的死亡受體介導(dǎo)的外源性凋亡通路,但通過caspase-9線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡通路卻很可能未被涉及。
　　 4：MTT分析Ad-p53與抗腫瘤藥物的聯(lián)合協(xié)同作用
　　 4.1：MSTO-211H和NIC-H28細胞用不同濃度的CDDP作用后,再進行Ad-p53轉(zhuǎn)導(dǎo)。結(jié)果顯示Ad-p53誘導(dǎo)增強了CDDP產(chǎn)生

10、的抗腫瘤效果,CalcuSyn軟件分析顯示Ad-p53和CDDP聯(lián)合應(yīng)用產(chǎn)生協(xié)同的癌細胞抑制作用。
　　 4.2：MSTO-211H和NIC-H28細胞用不同濃度的PEM作用后,再進行Ad-p53轉(zhuǎn)導(dǎo)。結(jié)果顯示Ad-p53誘導(dǎo)增強了PEM產(chǎn)生的抗腫瘤效果,CalcuSyn軟件分析顯示Ad-p53和PEM聯(lián)合應(yīng)用產(chǎn)生協(xié)同的癌細胞抑制作用。
　　 5：體內(nèi)抗腫瘤試驗結(jié)果
　　 間皮瘤細胞系(MSTO-211H)通過胸

11、腔注射到免疫缺陷老鼠的胸腔內(nèi),從而擴大其胸膜內(nèi)擴散轉(zhuǎn)移。給裸鼠胸腔內(nèi)注射Ad-p53,Ad-LacZ作為對照。28天的腫瘤重量顯示Ad-p53產(chǎn)生出抗腫瘤效果,而對照組Ad-LacZ治療卻沒能影響腫瘤重量。Ad-p53和CDDP給藥中,兩者均能單獨抑制腫瘤生長,但兩者聯(lián)用產(chǎn)生的抑制腫瘤能力大大優(yōu)于單用Ad-p53或單用CDDP。
　　 結(jié)論:
　　 1：Ad-p53以劑量依賴性的方式抑制了間皮瘤細胞的生長。
　　

12、 2：Ad-p53誘導(dǎo)間皮瘤細胞周期變化,從而導(dǎo)致細胞凋亡。
　　 3：Ad-p53激活了p53介導(dǎo)的分子傳導(dǎo)通路及外源性細胞凋亡通路。
　　 4：Ad-p53增強了抗腫瘤試劑的細胞毒性。
　　 5：Ad-p53和順鉑聯(lián)用產(chǎn)生協(xié)同的體內(nèi)抗腫瘤效果。
　　 綜上所述,Ad-p53轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制了間皮瘤細胞活性并以協(xié)同的方式增強了順鉑或培美曲塞的細胞增殖抑制效應(yīng),胸腔內(nèi)注射Ad-p53和順鉑全身給藥在原位動物模型產(chǎn)