β3整合素作為漢坦病毒受體的鑒定以及其它候選受體的篩選.pdf

1、一般來說，病毒與細(xì)胞膜上特異性受體結(jié)合是病毒感染細(xì)胞的起始環(huán)節(jié)，對(duì)于病毒能否成功感染細(xì)胞具有重要意義。病毒受體具有特異性、高親和性、結(jié)合位點(diǎn)有限性及相關(guān)生物學(xué)功能等特征。識(shí)別和鑒定病毒特異性結(jié)合的細(xì)胞膜受體不僅有益于了解病毒的組織嗜性、致病機(jī)制和生活周期，而且有利于制定預(yù)防和治療措施。 漢坦病毒(Hantavirus，HV)感染是嚴(yán)重威脅人類生命健康的全球性公共衛(wèi)生問題。盡管人們已經(jīng)對(duì)HV的基因組成、復(fù)制過程及生物學(xué)特征有相當(dāng)?shù)?/p>

2、了解，但對(duì)病毒感染的起始環(huán)節(jié)及受體的研究還不清楚)，而阻斷HV與其受體的結(jié)合是治療HV感染的重要途徑之一。目前關(guān)于HV受體的研究主要集中在細(xì)胞膜粘附蛋白p3整合素上，認(rèn)為p3整合素可能介導(dǎo)了HV入侵其宿主細(xì)胞，但是并沒有漢坦病毒包膜蛋白與β3整合素直接結(jié)合的證據(jù)，故β3整合素作為漢坦病毒的特異性受體還有待進(jìn)一步揭示；同時(shí)也有一些研究提示HV可能還存在有其它的候選受體或輔助受體分子，但需進(jìn)一步的研究來證實(shí)。 本課題利用基因重組技術(shù)

3、分別構(gòu)建了HV胞膜糖蛋白G2膜外區(qū)全長及各功能片段的真核表達(dá)載體以及β3整合素膜外區(qū)各截短片段的真核表達(dá)載體，通過Western blot檢測(cè)表達(dá)的效果。結(jié)果顯示β3整合素膜外區(qū)各片段在細(xì)胞裂解上清中均獲得大量表達(dá)，而HV胞膜蛋白G2僅有膜外區(qū)N端81-140位(G2N81-140)氨基酸片段在裂解上清中有大量表達(dá)，其余片段均主要存在于某種細(xì)胞器中。將G2N81-140真核表達(dá)質(zhì)粒與β3整合素各片段真核表達(dá)質(zhì)粒分別成對(duì)共轉(zhuǎn)染HEK293

4、細(xì)胞，免疫共沉淀驗(yàn)證兩者間的相互作用。結(jié)果表明G2與β3整合素可能存在著直接的相互作用，且作用位點(diǎn)位于G2 N端81-140片段與β3整合素27-133位氨基酸之間。構(gòu)建G2蛋白N端81-140片段的原核表達(dá)載體并通過SDS-PAGE檢測(cè)其在BL21表達(dá)菌中表達(dá)及純化的效果。將純化后的片段與β3整合素27-133位氨基酸片段孵育，GST pull-down驗(yàn)證它們之間的相互作用，結(jié)果也顯示兩者間存在著直接的相互作用。用生物素標(biāo)記HV易感

5、細(xì)胞VeroE6及非允許細(xì)胞CHO細(xì)胞膜蛋白，將純化的原核表達(dá)G2N81-140片段作為探針與經(jīng)過GST蛋白預(yù)處理的含有生物素標(biāo)記細(xì)胞膜蛋白的VeroE6裂解液進(jìn)行孵育，同時(shí)以非允許細(xì)胞CHO和無關(guān)蛋白GST-TLMM做為陰性對(duì)照，通過GST pull-down分離與G2蛋白相互作用的細(xì)胞膜蛋白。結(jié)果顯示一個(gè)約30KDa的細(xì)胞膜蛋白與G2N81-140氨基酸片段之間存在著特異性相互作用，表明該30KDa蛋白可能是HV細(xì)胞膜候選受體或受體