桑樹MaPGIP1基因克隆與表達(dá)分析.pdf

1、桑樹為多年生木本植物，屬于薔薇目(Rosales)桑科(Moraceae)桑屬(Morus L.)桑種(Morusalba L.)。桑樹長(zhǎng)期以來作為家蠶的飼料樹種，是“桑蠶-絲”產(chǎn)業(yè)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，但桑樹還具有多種用途，如較強(qiáng)的生態(tài)學(xué)功能以及食用和藥用等價(jià)值，發(fā)展果桑產(chǎn)業(yè)在蠶桑資源綜合利用方面優(yōu)勢(shì)明顯，對(duì)優(yōu)化蠶桑產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)，促進(jìn)蠶農(nóng)增收具有重要意義。但果桑產(chǎn)業(yè)面臨著菌核病的嚴(yán)重威脅，該病是危害桑椹的主要真菌病害，其分布廣泛，病勢(shì)猛，對(duì)果桑

2、產(chǎn)業(yè)危害極大。
　　植物細(xì)胞壁是抵御病原菌侵染的第一道物理屏障。許多致病真菌能分泌多種水解植物細(xì)胞壁的酶類，多聚半乳糖醛酸酶(PG)是真菌分泌的第一個(gè)水解酶，被認(rèn)為是一種重要的致病因子。多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)是普遍存在植物細(xì)胞壁的一種糖蛋白，能特異性的識(shí)別并抑制真菌PG酶，從而阻止了病原菌對(duì)植物的入侵。另外，PGIP對(duì)PG的抑制導(dǎo)致植物體內(nèi)積累有生物活性的寡糖，從而誘發(fā)植物抗病響應(yīng)。PGIP是植物重要的防御蛋白，屬于

3、LRR蛋白超家族的一員。本研究從分析川桑基因組信息入手，以重慶市審定的果桑品種‘嘉陵40號(hào)’(Morus atropurpureaRoxb.)為材料，從分子生物學(xué)角度，研究桑樹PGIP基因特征、表達(dá)及對(duì)煙草的遺傳轉(zhuǎn)化。旨為桑樹功能基因研究與應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得抗真菌病害的植物育種研究提供參考。本研究的結(jié)果如下:
　　1、桑樹MaPGIP1基因克隆與生物信息分析
　　根據(jù)川?；蚪M數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)的PGIP基因設(shè)計(jì)

4、引物，用嘉陵40號(hào)桑作為供試材料，以cDNA為模板，克隆桑樹PGIP基因的全長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果是:其CDS序列全長(zhǎng)為1017bp，編碼338個(gè)氨基酸。將該基因序列提交至NCBI，基因登錄號(hào)為GenBank: KJ704112，并命名為MaPGIP1。在線軟件預(yù)測(cè)MaPGIP1蛋白分子量37.9 kDa，理論等電點(diǎn)為6.65，分子式C1717H2650N442O495S14，酸性氨基酸(Asp+Glu)占9.8％，堿性氨基酸(Lys+Arg)占

5、9.5％，亮氨酸比例最高(13.3％);不穩(wěn)定系數(shù)為38.71，說明該蛋白為穩(wěn)定蛋白。MaPGIP1的信號(hào)肽為N端26個(gè)氨基酸殘基。MaPGIP1成熟肽氨基酸序列中具有4個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)，N端和C端各有4個(gè)參與二硫鍵形成的半胱氨酸殘基。該基因編碼的蛋白質(zhì)主體結(jié)構(gòu)由9個(gè)串聯(lián)的LRRs基序組成;MaPGIP1氨基酸序列從第76個(gè)氨基酸開始的LRRs基序均具有“LxxLxLxxNxLS/TGxIPxxLxxL”（x代表任意氨基酸殘基）這

6、樣的共有序列。
　　運(yùn)用Muscle軟件，對(duì)獲得的MaPGIP1基因進(jìn)行氨基酸序列的多重比對(duì)分析，與已經(jīng)報(bào)道的擬南芥、菜豆和中國李PGIP蛋白的氨基酸序列同源性高達(dá)50％-65％，與川桑PGIP氨基酸序列同源性為84％，其序列的差異主要體現(xiàn)在非保守位點(diǎn)上。將獲得的桑樹MaPGIP1與已報(bào)道的其他物種的PGIP蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，聚類分析發(fā)現(xiàn)，PGIP蛋白的氨基酸序列分成2支，分別為單子葉植物和雙子葉植物。MaPGIP1與薔薇科

7、的中國李和桃等親緣關(guān)系比較近。
　　2、桑樹MaPGIP1基因組織表達(dá)分析及對(duì)非生物誘導(dǎo)響應(yīng)
　　本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)研究了MaPGIP1基因在不同組織和桑椹不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)水平以及對(duì)非生物的誘導(dǎo)響應(yīng)。發(fā)現(xiàn)該基因在根中的表達(dá)量最高，在幼葉中表達(dá)量次之，在皮中的表達(dá)量最低;另外，該基因在果實(shí)發(fā)育前中期的表達(dá)水平明顯高于后期;又分析檢測(cè)了經(jīng)水楊酸(SA)、脫落酸(ABA)、損傷以及低溫(4℃)處理24h的桑葉片中MaP

8、GIP1基因表達(dá)水平。結(jié)果表明，SA處理后，MaPGIP1的表達(dá)水平顯著升高，在處理3h后表達(dá)量最高，是未處理的25倍;ABA處理后，MaPGIP1基因表達(dá)水平降低到原來的五分之一到六分之一。機(jī)械損傷處理后，MaPGIP1表達(dá)水平升高，在6h表達(dá)量最高，是對(duì)照的4.5倍;低溫處理后，MaPGIP1基因表達(dá)表達(dá)水平先下降有上升再下降的趨勢(shì)，6h基因表達(dá)表達(dá)水平上調(diào)，是對(duì)照的1.4倍;24h表達(dá)水平是處理前的十分之一。
　　3、桑樹M

9、aPGIP1基因原核表達(dá)與功能分析
　　將MaPGIP1基因亞克隆到原核表達(dá)載體pET28a(+)中，成功的構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET28a-PGIP。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，加入IPTG（終濃度0.5 mmol/L）進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。目的蛋白以包涵體的形式存在。采用超聲波破碎方法裂解細(xì)胞，然后用8mol/L尿素溶解表達(dá)產(chǎn)物，通過Ni-NTA柱純化收集融合蛋白，純化后的目的蛋白經(jīng)Western Blot檢測(cè)，利用含有氧化還原

10、系統(tǒng)的復(fù)性緩沖液分步透析復(fù)性，最終獲得了具有活性的蛋白。
　　通過對(duì)離體的油菜葉片接種果桑肥大性菌核病菌（Ciboria shiraiana）證明MaPGIP1蛋白對(duì)該菌的抑制。實(shí)驗(yàn)表明MaPGIP1蛋白對(duì)該菌在侵染油菜前期有一定的抑制效果，能緩解油菜葉片的感病癥狀。通過DNS法測(cè)定MaPGIP1蛋白對(duì)CsPG的抑制效果，結(jié)果表明，隨著MaPGIP1蛋白量的增加，CsPG將聚半乳糖醛酸裂解成D-半乳糖醛酸的量逐漸減少，這說明該菌對(duì)