SYBR GreenⅠ熒光PCR檢測犬傳染性肝炎病毒方法的建立及其初步應(yīng)用.pdf

1、犬傳染性肝炎是由I型腺病毒引起的犬的一種烈性傳染病,其發(fā)病率和致死率都很高,是危害犬最為嚴重的疾病之一。迄今為止,該病的診斷方法主要有血凝(HA)和血凝抑制(HI)試驗、間接血凝試驗(IHA)、瓊脂擴散試驗(AGP)、酶標抗體技術(shù)、常規(guī)PCR等多種方法。這些方法普遍存在特異性差、耗時長、靈敏度低、易出現(xiàn)假陽性等問題,致使病原診斷始終較困難,所以尋找一種快速準確的診斷方法顯得尤為重要。 實時熒光PCR技術(shù)是一種新型的核酸檢測技術(shù),

2、具有極大的應(yīng)用價值,在臨床診斷中已經(jīng)用于細菌、病毒及遺傳性疾病的檢測。本研究針對犬傳染性肝炎病毒(CAV-I)的保守核苷酸序列設(shè)計一對引物,以此引物和CAV-I的標準毒株DNA為模板,建立并優(yōu)化了SYBR Green I熒光PCR檢測犬傳染性肝炎病毒的方法,待測樣品的檢測結(jié)果可以根據(jù)擴增曲線和Tm值進行判定。把擴增區(qū)克隆測序鑒定,其產(chǎn)物長度為100bp,確認設(shè)計引物正確,同時并把克隆質(zhì)粒作為該方法的陽性對照；特異性試驗研究表明,只有CA

3、V-I可被特異性擴增,其產(chǎn)物的Tm值為79±0.5℃,而其他干擾毒株均沒有典型擴增曲線和熔解曲線；敏感性試驗結(jié)果顯示該方法比常規(guī)PCR方法敏感100倍以上,可以全面代替并優(yōu)于常規(guī)PCR方法；本研究還對所建立的試驗方法進行了初步應(yīng)用,用SYBR Green I熒光PCR方法與酶聯(lián)免疫吸附試驗和血凝試驗對送檢的46個出入境樣品進行了檢測比對,結(jié)果表明該方法更適于出入境犬傳染性肝炎的檢疫。 該方法與普通PCR相比具有閉管操作、無需后處