犬傳染性肝炎病毒六鄰體Loop基因的表達(dá)及其單克隆抗體的制備.pdf

1、目的：犬傳染性肝炎(Infectious canine hepatitis，ICH)是由犬傳染性肝炎病毒(Infectious canine hepatitis virus，ICHV)引起的一種常見的急性敗血性傳染病。本病多發(fā)生于1歲以內(nèi)的幼犬，死亡率高達(dá)40％，對實(shí)驗(yàn)動物犬和其它養(yǎng)犬業(yè)均有較大的影響。該病的緊急預(yù)防或治療，可使用同型或異型免疫血清或丙種球蛋白，但對犬的保護(hù)效果有限。目前世界上用于緊急預(yù)防和治療犬病毒性傳染病，如犬瘟熱、

2、犬細(xì)小病毒感染等，最好的方法是使用具有中和病毒作用的單克隆抗體(monoclonal antibody，McAb)。目前尚未見成功制備ICHV六鄰體蛋白單克隆抗體的報道。 ICHV，又稱犬腺病毒(Canine adenovirus，CAV)，屬于腺病毒科哺乳動物腺病毒屬成員，是在已發(fā)現(xiàn)的哺乳動物腺病毒屬中致病性最強(qiáng)、形態(tài)結(jié)構(gòu)也研究得比較清楚的一種動物病毒。ICHV是無包膜的球形結(jié)構(gòu)，衣殼由六鄰體蛋白、五鄰體蛋白和纖維蛋白組成。對

3、六鄰體蛋白的結(jié)構(gòu)和功能研究表明六鄰體蛋白可以引發(fā)極強(qiáng)的中和反應(yīng)，中和抗原決定簇主要存在六鄰體蛋白上，當(dāng)六鄰體蛋白被替代或突變將導(dǎo)致中和免疫的缺失。六鄰體分子有一個五面體的基底和三角形的塔尖，基底包含兩個區(qū)域P1、P2區(qū)，塔區(qū)由4個環(huán)構(gòu)成即Loop1、Loop2、Loop3、Loop4。Loop1是最長、最復(fù)雜的環(huán)，自身折疊許多倍，與周圍環(huán)境相互作用。對15個不同型的腺病毒的六鄰體蛋白的序列研究表明，基底區(qū)P1、P2是保守的，變化區(qū)主要集

4、中在Loop1、Loop2上。Loop1、Loop2存在有7個獨(dú)特的超變區(qū)(Hypervariable Region，HVR)，在這7個}tVRs中，HVR1-HVR6出現(xiàn)在Loop1中，HVR7出現(xiàn)在Loop2的塔尖。其中HVR1、HVR2、HVR4、HVR5、HVR7中都含有中和抗原決定簇，表明六鄰體中主要抗原決定簇就集中在Loop1區(qū)和Loop2區(qū)。本室參考已發(fā)表的Ⅰ型犬腺病毒基因序列設(shè)計(jì)了引物，克隆了ICHV分離株六鄰體蛋白Lo

5、op1、Loop2基因，連接了Loop1、Loop2基因并將其定向克隆到原核表達(dá)載體pET28a中，命名為pET28aLoop。本研究將pET28aLoop轉(zhuǎn)化到工程菌BL21(DE3)中，誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，利用金屬鎳螯合的Ni-NTA親和層析柱對重組的Loop蛋白進(jìn)行純化，以純化的重組蛋白免疫BALB/c小鼠，取脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合，篩選分泌犬肝炎病毒特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，接種至小鼠腹腔得到含有單克隆抗體的腹水，篩選具有

6、中和ICHV作用的單克隆抗體。 方法： 1、將原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)Loop轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，涂瓊脂板，挑單克隆菌，搖菌并用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷酶(IPTG)誘導(dǎo)重組Loop蛋白的表達(dá)，SDS-PAGE電泳觀察結(jié)果，Western blotting鑒定。菌體超聲破碎，取上清和沉淀用于SDS-PAGE電泳，進(jìn)行重組蛋白的可溶性分析。用尿素溶解沉淀，采用鎳離子親和層析柱純化重組蛋白，透析后濃縮目

7、的蛋白。 2、重組蛋白聯(lián)合弗氏佐劑免疫雌性BALB/c小鼠三次，每次免疫間隔為兩周，融合前3天用抗原蛋白加強(qiáng)。以病毒為包被抗原，采用ELISA方法檢測小鼠血清抗體效價。取免疫鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0在50％PEG4000下進(jìn)行融合，經(jīng)HAT培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)，用間接ELISA法篩選陽性克隆，有限稀釋法進(jìn)行克隆化。獲得穩(wěn)定分泌抗ICHV單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，接種小鼠腹腔制備腹水。 3、單克隆抗體鑒定：以ICHV為抗

8、原包被，采用間接ELISA法測定腹水單克隆抗體效價；雜交瘤細(xì)胞染色體分析；檢測雜交瘤細(xì)胞腹水的血凝抑制抗體效價及中和抗體效價；免疫印跡分析單克隆抗體特異性；采用間接ELISA相加實(shí)驗(yàn)方法分析單克隆抗體的抗原表位；采用辛酸-硫酸銨法純化腹水單克隆抗體，SDS-PAGE鑒定單克隆抗體純度。 結(jié)果： 1、重組質(zhì)粒pET28aLoop轉(zhuǎn)化表達(dá)菌BL21(DE3)誘導(dǎo)表達(dá)后，經(jīng)SDS-PAGE電泳，誘導(dǎo)表達(dá)菌在36kDa處出現(xiàn)一條

9、蛋白表達(dá)條帶，對照組無此條帶。 2、Western blotting結(jié)果顯示誘導(dǎo)表達(dá)蛋白與抗六聚組氨酸抗體特異性結(jié)合。 3、蛋白可溶性分析：超聲破菌離心后，沉淀中含有大量分子量為36kDa的蛋白，上清中蛋白量較少。 4、誘導(dǎo)表達(dá)的Loop蛋白經(jīng)鎳離子親和層析純化，純度可達(dá)95％以上。 5、以重組蛋白作為抗原免疫小鼠，E12SA方法檢測血清抗體效價高于1：320。 6、經(jīng)2次細(xì)胞融合，960孔中有2

10、01孔長出雜交瘤細(xì)胞，融合率為21％。間接ELISA檢測其中2孔為陽性。經(jīng)克隆化培養(yǎng)篩選得到35株雜交瘤細(xì)胞株，液氮凍存。 7、雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清抗體最高效價達(dá)1：1.28×10<'3>，腹水抗體最高效價達(dá)1：10<'4>。 8、雜交瘤細(xì)胞染色體計(jì)數(shù)結(jié)果為92～100條之間。 9、血凝抑制實(shí)驗(yàn)表明細(xì)胞株2-7F9和2-1B1腹水血凝抑制抗體效價分別為1：640和1：320；細(xì)胞株1-7G3和1-8E6腹水未發(fā)現(xiàn)

11、有血凝抑制作用。 10、2-7F9 McAb的中和效價為1：64，2-1B1中和效價為1：32，1-7G3和1-8E6無中和效價。 11、McAb表位分析結(jié)果：2-7F9和2-181兩株McAb相加指數(shù)AI為47％。 12、McAb的特異性：Western blotting結(jié)果為2-7F9和2-181 McAb與誘導(dǎo)菌在36kDa處有特異性條帶；與ICHV在約101kDa處有特異性條帶；對照組均未出現(xiàn)相應(yīng)條帶。

12、 13、腹水純化：取1ml腹水純化后行SDS-PAGE電泳，結(jié)果可見在25kDa和50kDa有抗體輕鏈、重鏈的特異條帶，并且在97.4kDa與66.2kDa之間、大于97.4kDa各有一條電泳條帶；而腹水電泳條帶較多。 結(jié)論： 1、本課題成功誘導(dǎo)、表達(dá)、純化并鑒定了ICHV重組Loop蛋白，為深入研究ICHV Loop1、Loop2基因及其編碼蛋白的功能提供了材料，同時為開發(fā)新的ICH基因工程產(chǎn)品奠定了良好的基礎(chǔ)。