金欣口服液對(duì)RSV活化誘導(dǎo)的TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用機(jī)制研究.pdf

1、呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）是世界范圍內(nèi)嬰幼兒最重要的病毒性下呼吸道感染病毒病原[1]，目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)尚無特效的抗RSV藥物，相關(guān)疫苗的開發(fā)也尚未成熟。Delgado，M.F.等2009年在《Nat Med》中提出，滅活的RSV疫苗是確保嬰幼兒接種疫苗安全性的關(guān)鍵因素，因其通過Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)的刺激可增強(qiáng)保護(hù)性抗原表位的抗體親和力。TLR

2、s作為重要的模式識(shí)別受體(pattern recognitionreceptors，PRRs)類型，在RSV感染過程中發(fā)揮著重要的作用，它能識(shí)別出不同微生物的病原相關(guān)分子模式（pathogen associated molecule pattem，PAMP），是研究RSV感染的新的方向。中醫(yī)藥以辨證論治及整體觀念為基礎(chǔ)，提出清肺、化痰、止咳等一系列具有中醫(yī)特色的抗RSV感染的方法，并取得良好的臨床療效，導(dǎo)師汪受傳教授帶領(lǐng)的團(tuán)隊(duì)承擔(dān)的國家

3、自然科學(xué)基金項(xiàng)目“金欣口服液對(duì)RSV活化的TLRs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作用機(jī)制研究(81072840)”，前期研究成果已證實(shí)金欣口服液能夠調(diào)控RSV感染活化誘導(dǎo)的TLR3(sTLR3)、TLR7(sTLR7)及部分TLR4(sTLR4)下游信號(hào)分子的表達(dá)水平。金欣口服液有明顯抑制RSV的作用，病毒的F蛋白或其受體可能是其作用位點(diǎn);這些研究結(jié)果為治療嬰幼兒RSV肺炎提供了新的思路。
　　鑒于中醫(yī)藥的多靶點(diǎn)作用，本實(shí)驗(yàn)從TLR4及其介導(dǎo)的信號(hào)

4、通路入手，采用RNA干擾(RNAi)技術(shù)，探討金欣口服液抗對(duì)RSV誘導(dǎo)的TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控，及與其它TLRs的相關(guān)性。
　　1目的：
　　研究金欣口服液對(duì)RSV誘導(dǎo)的TLR4信號(hào)傳導(dǎo)通路的調(diào)控作用，并從微觀角度探討金欣口服液治療RSV肺炎的免疫學(xué)機(jī)制。
　　2方法：
　　體外實(shí)驗(yàn):采用金欣口服液含藥血清進(jìn)行干預(yù)體外培養(yǎng)的受RSV感染的RAW264.7細(xì)胞，24h后收集細(xì)胞，并用TLR4 siRNA干擾后檢

5、測(cè)TLR4及轉(zhuǎn)化生長因子β活化激酶(TAK1)相關(guān)指標(biāo)，觀察轉(zhuǎn)染后的金欣口服液對(duì)RAW264.7細(xì)胞TLR4 mRNA、TAK1mRNA水平及蛋白表達(dá)的影響，觀察金欣口服液對(duì)RSV誘導(dǎo)的TLR4傳導(dǎo)通路影響及與其它TLRs信號(hào)通路的相關(guān)性。
　　體內(nèi)實(shí)驗(yàn):RSV滴鼻感染BALB/c小鼠，金欣口服液進(jìn)行干預(yù)，并于首次滴鼻后24小時(shí)，取小鼠肺組織，行病理組織切片以評(píng)價(jià)肺部病變情況，并運(yùn)用Western Blot法檢測(cè)小鼠肺組織TLR4

6、、TAK1蛋白表達(dá)情況。
　　3結(jié)果：
　　3.1體外實(shí)驗(yàn)
　　3.1.1 TLR4 siRNA轉(zhuǎn)染后
　　(1) TLR4 siRNA轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞干擾了TLR4的表達(dá)。轉(zhuǎn)染后，TLR4 mRNA的表達(dá)下降了0.456倍，表明用TLR4 siRNA轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞干擾TLR4 mRNA的生成模型復(fù)制是成功的。RSV組TLR4 mRNA的表達(dá)較正常組下調(diào)明顯，金欣口服液組與RSV組相比TLR4

7、mRNA的表達(dá)有所上升(△P＜0.05)，故金欣口服液含藥血清可上調(diào)RSV誘導(dǎo)的TLR4 mRNA的表達(dá)。
　　(2) TLR4 siRNA轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞后，可見TAK1 mRNA的表達(dá)有所下調(diào)，RSV感染后，TAK1 mRNA的表達(dá)下降了0.632倍，與轉(zhuǎn)染組相比利巴韋林與金欣含藥血清均可上調(diào)TAK1mRNA的表達(dá)(▲▲P＜0.01)，金欣口服液組和利巴韋林組與RSV組相比表達(dá)有所上升(★★P＜0.01)，且金欣口服液

8、上升更明顯。
　　(3)使用TLR4 siRNA轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞干擾了TLR4的表達(dá)，轉(zhuǎn)染后，可見TLR4蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，RSV組與TLR4 siRNA轉(zhuǎn)染組相比蛋白表達(dá)存在差異(P＜0.01)。與轉(zhuǎn)染組相比利巴韋林注射液、金欣含藥血清均可上調(diào)TLR4蛋白的表達(dá)，且金欣口服液的上調(diào)較利巴韋林明顯(P＜0.05)
　　(4)轉(zhuǎn)染后，RSV感染RAW264.7細(xì)胞可見TAK1蛋白存在明顯的改變，轉(zhuǎn)染組較正常組有明顯下調(diào)

9、(P＜0.01)，RSV感染組較轉(zhuǎn)染組有所下調(diào)(P＜0.01)。利巴韋林、金欣含藥血清可下調(diào)TAK1蛋白的表達(dá)(P＜0.01)，但利巴韋林組下調(diào)更加明顯，兩者之間差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3.2體內(nèi)試驗(yàn)
　　3.2.1 RSV感染24小時(shí)后BALB/c小鼠肺臟病理結(jié)果顯示金欣口服液組肺內(nèi)炎癥均有不同程度減輕，病理評(píng)分結(jié)果顯示治療組各時(shí)間點(diǎn)與RSV感染組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異(P＜0.05)。
　　3.

10、2.2金欣口服液對(duì)RSV感染BALB/c小鼠肺組織TLR4、TAK1表達(dá)的影響:RSV感染24h后，TLR4、TAK1蛋白的表達(dá)與正常照相比明顯升高(P＜0.01)，而與RSV感染組相比，金欣口服液則能降低RSV感染后TLR4、TAK1蛋白表達(dá)水平(P＜0.05），效果優(yōu)于利巴韋林組(P＜0.01)，同時(shí)根據(jù)Pearson相關(guān)系數(shù)r=0.980、P=0.000＜0.01，我們可以認(rèn)為TLR4與TAK1的蛋白表達(dá)呈正向直線相關(guān)。
　

11、　4結(jié)論：
　　4.1金欣口服液對(duì)減輕RSV感染小鼠的肺部炎癥具有明顯效果，并且在疾病早期其作用略優(yōu)于利巴韋林。
　　4.2金欣口服液能抑制TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中TLR4/TAK1蛋白的表達(dá)，而TLR4的蛋白表達(dá)與TAK1的蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，二者呈平行抑制關(guān)系，也就是說金欣口服液發(fā)揮抗RSV作用機(jī)制中的TLR4信號(hào)通路途徑可能是通過TAK1來發(fā)揮作用的
　　4.3 TLR4 siRNA轉(zhuǎn)染后，TLR4 mRNA及蛋白表