鼠巨細(xì)胞病毒感染小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞對共培養(yǎng)T細(xì)胞功能及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分化的影響.pdf

1、[目的] ①在體外細(xì)胞水平研究巨細(xì)胞病毒感染星形膠質(zhì)細(xì)胞對T細(xì)胞免疫的影響； ②探明巨細(xì)胞病毒感染對星形膠質(zhì)細(xì)胞-T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群分化擴(kuò)增的影響及其可能機(jī)制； ③研究大蒜新素對巨細(xì)胞病毒感染引起的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比率失衡的作用并探討其機(jī)制。 [方法] ①M(fèi)CMV感染星形膠質(zhì)細(xì)胞模型的建立：進(jìn)行BALB/c小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的原代和傳代培養(yǎng)；使用免疫組化法檢測特異性標(biāo)志物驗(yàn)證星形膠質(zhì)

2、細(xì)胞的純度；給予MCMV攻擊星形膠質(zhì)細(xì)胞后，通過觀察細(xì)胞病變、含Lac-Z基因重組病毒株MCMVRM461的X-gal顯色，以及繪制病毒生長曲線等方法判定傳代星形膠質(zhì)細(xì)胞對MCMV的易感性和感染狀態(tài)。 ②T淋巴細(xì)胞-MCMV感染星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)的建立：提取MCMV預(yù)感染BALB/c小鼠2個月后的脾臟和淋巴結(jié)，使用尼龍毛法分離純化T淋巴細(xì)胞；流式細(xì)胞術(shù)檢測所獲淋巴細(xì)胞中CD3+細(xì)胞的比率，驗(yàn)證T淋巴細(xì)胞的純度；MCMV感染星

3、形膠質(zhì)細(xì)胞(感染復(fù)數(shù)為0.01)后，與分離獲得的T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)。 ③觀察T淋巴細(xì)胞-MCMV感染星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)中T細(xì)胞免疫的狀況： 采用克隆觀察法和熒光素CFDA-SE標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測的方法來研究T細(xì)胞增殖狀況；雙抗體夾心ELISA法檢測共培養(yǎng)上清中Th1類細(xì)胞因子IFN-γ和TNF-α水平來評估T細(xì)胞活化分泌水平；采用細(xì)胞病變觀察法和PCR檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞中MCMVDNA負(fù)荷量變化來判斷T細(xì)胞是否能發(fā)揮免疫

4、保護(hù)作用。 ④研究MCMV感染對T淋巴細(xì)胞-星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分化、種群擴(kuò)增的影響：分別于共培養(yǎng)前和共培養(yǎng)后24h、48h、72h，使用RT-PCR法檢測T細(xì)胞中Foxp3mRNA表達(dá)水平的變化；使用流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+CD25+細(xì)胞在CD4+細(xì)胞中所占比率的變化；使用單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)觀察與感染星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)72h后T細(xì)胞增殖能力的變化。 ⑤采用RT-PCR法研究MCMV感染對星形膠質(zhì)細(xì)胞TG

5、F-betamRNA表達(dá)的影響。 ⑥研究大蒜新素處理對MCMV感染星形膠質(zhì)細(xì)胞-T細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的影響：使用MTT法測定星形膠質(zhì)細(xì)胞對大蒜新素的最大耐受濃度(MTC)；MTC大蒜新素處理共培養(yǎng)的MCMV感染星形膠質(zhì)細(xì)胞與T細(xì)胞72h后，采用RT-PCR法檢測T細(xì)胞中Foxp3mRNA表達(dá)水平的變化；使用流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+CD25+細(xì)胞在CD4+細(xì)胞中所占比率的變化。 ⑦采用RT-PCR法觀察MTC大蒜新

6、素處理的MCMV感染星形膠質(zhì)細(xì)胞中TGF-betamRNA表達(dá)的影響，探討藥物影響病毒誘導(dǎo)Treg分化擴(kuò)增的機(jī)制。 [結(jié)果] ①獲得高純度(＞95％)的傳代星形膠質(zhì)細(xì)胞。其被MCMV感染后，能夠產(chǎn)生典型細(xì)胞病變，表達(dá)MCMV重組毒株的Lac-Z基因，并釋放出具有感染能力的子代病毒。病毒生長曲線顯示，MCMV能在星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)較快速的復(fù)制繁殖，說明傳代星形膠質(zhì)細(xì)胞充分支持MCMV的產(chǎn)毒性感染。 ②使用尼龍毛法分離獲

7、得較高純度的T淋巴細(xì)胞，CD3陽性率＞95％。成功建立T淋巴細(xì)胞-MCMV感染星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)模型。 ③T淋巴細(xì)胞-MCMV感染星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)3d，可觀察到T細(xì)胞聚集和克隆生成；CFDA-SE標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測證明，MCMV感染組T細(xì)胞增殖率為6.68±0.61％，與非感染對照(1.07±0.03％)相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。MCMV感染組培養(yǎng)上清中IFN-γ濃度為22.9±3.35pg/ml，但TNF-α水平低

8、于試劑盒檢測范圍(＜8pg/ml)，非感染對照中2種因子均未檢出。T細(xì)胞共培養(yǎng)3d，能夠減少31.25％～75％的星形膠質(zhì)發(fā)生細(xì)胞病變，抑制率隨添加T細(xì)胞比例增多而增高；同時MCMVDNA載量也明顯減少，PCR顯示MCMVDNA擴(kuò)增條帶明顯減弱。 ④T淋巴細(xì)胞-MCMV感染星形膠質(zhì)細(xì)胞共培3d的培養(yǎng)上清也能夠減少M(fèi)CMV感染導(dǎo)致的星形膠質(zhì)細(xì)胞病變，抑制率達(dá)81.25％；能夠明顯減少M(fèi)CMVDNA載量，抑制率為70％。 ⑤

9、與MCMV感染星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)3d后的T細(xì)胞再次接觸MCMV感染星形膠質(zhì)細(xì)胞時，發(fā)生增殖的細(xì)胞比率明顯降低，僅1.83±0.25％，與新分離的T細(xì)胞相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)；未能檢出IFN-γ的分泌；不能抑制病毒導(dǎo)致的細(xì)胞病變；對MCMVDNA載量無影響(與病毒感染對照相比，P＞0.05)，提示共培養(yǎng)3d后的T細(xì)胞功能受到抑制。 ⑥T細(xì)胞Foxp3mRNA表達(dá)和CD4+CD25+細(xì)胞比率變化相似，在與MCMV感染星形膠

10、質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)24h后均已明顯增多，并隨時間延長而有逐漸增多趨勢，在共培養(yǎng)后72h增長最為明顯，與共培養(yǎng)前和非感染對照相比有顯著差異(P＜0.01)。在單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中測得與感染星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)3天T細(xì)胞的刺激指數(shù)為1.18±0.06，明顯低于對照組的1.78±0.13(P＜0.01)，說明T細(xì)胞的增殖能力在與感染星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)72h后受到抑制。 ⑦在CMV感染后72h，星形膠質(zhì)細(xì)胞的TGF-betamRNA表達(dá)顯著上

11、調(diào)，比正常對照升高了近一倍(P＜0.01)。 ⑧MTT法測得星形膠質(zhì)細(xì)胞對大蒜新素的最大耐受濃度為9.6μg/mL。用9.6μg/mL大蒜新素處理，可以降低感染共培養(yǎng)系統(tǒng)中T細(xì)胞Foxp3mRNA的表達(dá)水平(P＜0.01)和CD4+CD25+T細(xì)胞比率(P＜0.01)；但仍高于正常對照組(P＜0.05)。MCMV感染星形膠質(zhì)細(xì)胞中TGF-betamRNA表達(dá)水平在9.6μg/mL大蒜新素處理后也明顯降低(P＜0.05)，但仍然高

12、于正常細(xì)胞對照(P＜0.01)。 [結(jié)論] ①成功建立MCMV感染星形膠質(zhì)細(xì)胞-T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)模型，為研究巨細(xì)胞病毒中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染免疫提供體外細(xì)胞水平研究的平臺。 ②小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞在感染CMV后能夠刺激T細(xì)胞增殖活化；T細(xì)胞免疫能夠發(fā)揮一定程度的保護(hù)作用，這種保護(hù)作用有部分是由分泌性的細(xì)胞因子介導(dǎo)的；T細(xì)胞活化后功能很快受到抑制，其中存在復(fù)雜的機(jī)制。 ③CMV感染星形膠質(zhì)細(xì)胞后能促進(jìn)共培養(yǎng)T細(xì)胞內(nèi)F

13、oxp3基因表達(dá)和Treg比例上升；增多的Treg可能發(fā)揮一定的免疫抑制功能。CMV感染導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞TGF-beta表達(dá)水平升高，可能是其促進(jìn)Treg誘導(dǎo)分化，實(shí)現(xiàn)Treg種群擴(kuò)增的重要機(jī)制。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的環(huán)境有利于Treg的分化，是機(jī)體免疫自穩(wěn)的重要保護(hù)機(jī)制。另一方面，CMV感染誘導(dǎo)病變局部Treg種群擴(kuò)增，又是其逃避特異性免疫、實(shí)現(xiàn)長期潛伏的機(jī)制之一。 ④大蒜新素能部分抵消CMV感染導(dǎo)致的Treg比率失衡，抑制TGF-b