Shh基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療慢性缺血性心臟病的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、冠心病是危及人類健康的一種常見(jiàn)疾病。近年來(lái),隨著人民生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變,我國(guó)冠心病發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。冠心病已成為當(dāng)前危害國(guó)人身體健康的最主要疾病之一。
　　 由于成熟的心肌細(xì)胞屬于終末分化細(xì)胞,再生能力很弱,一旦心肌遭受不可逆的損傷將導(dǎo)致心肌細(xì)胞減少,損傷區(qū)難以依靠殘余的心肌細(xì)胞的增生進(jìn)行修復(fù),多以纖維瘢痕組織增生來(lái)替代壞死的心肌,從而導(dǎo)致心室結(jié)構(gòu)的改變,心肌順應(yīng)性下降,心臟壁擴(kuò)張變薄,導(dǎo)致心功能減退,嚴(yán)重影響患者的

2、生存質(zhì)量及生活。因此,增加具有完善收縮功能的心肌細(xì)胞數(shù)目可能成為治療冠心病的有效途徑。傳統(tǒng)的治療方法,無(wú)論是藥物治療,手術(shù)治療或者是介入治療均不能增加心肌細(xì)胞,修復(fù)梗死心肌。
　　 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是存在于骨髓中的一類非造血干細(xì)胞,是中胚層發(fā)育的早期細(xì)胞,具有多向分化潛能。同時(shí),由于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化和增殖潛能,易于使外源的基因的得到長(zhǎng)期和穩(wěn)定的表達(dá),并且易與周圍組織整合而發(fā)揮功能,使其成為基因治療中非常有價(jià)值的運(yùn)載細(xì)

3、胞。
　　 Shh基因能調(diào)節(jié)基質(zhì)細(xì)胞分泌眾多的血管新生因子,促進(jìn)毛細(xì)血管新生和動(dòng)脈生成,減少心肌細(xì)胞凋亡,促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移,從而更好的增加心梗區(qū)血供,恢復(fù)心肌細(xì)胞數(shù)目,改善心功能。
　　 由此,我們?cè)O(shè)想將細(xì)胞移植和血管新生療法兩種方法結(jié)合,針對(duì)心梗后心肌細(xì)胞喪失和相對(duì)性缺血缺氧的特點(diǎn),采用細(xì)胞移植技術(shù),聯(lián)合基因治療,以求更好的實(shí)現(xiàn)心梗后心肌再生和血管新生。
　　 本實(shí)驗(yàn)分為兩個(gè)部分。第一部分:Shh基因轉(zhuǎn)染BM

4、MSC。以密度梯度離心-貼壁培養(yǎng)法獲取Wistar大鼠BMMSC,采用電轉(zhuǎn)染法將Shh基因?qū)隑MMSC;第二部分:Shh基因轉(zhuǎn)染BMMSC移植對(duì)大鼠心功能的影響。將攜帶Shh基因的BMMSC直接心肌注射到心梗區(qū)及其周緣,定期(1周、2周、4周、8周)通過(guò)檢測(cè)心功能、移植細(xì)胞的存活和分化等指標(biāo),來(lái)檢驗(yàn)是否優(yōu)于獨(dú)立的細(xì)胞治療或基因治療。
　　 第一部分:Shh基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞
　　 目的:探討對(duì)大鼠BMMSC進(jìn)行重

5、組Shh基因修飾的可行性。
　　 方法:1.采用密度梯度離心-貼壁培養(yǎng)法獲Wistar大鼠BMMSC。測(cè)定其生長(zhǎng)曲線,表面標(biāo)志CD34、CD44、CD45和SH3。2.采用電轉(zhuǎn)染法將PCDNA3.1(-)-SHH轉(zhuǎn)染BMMSC,在倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)情況的變化,通過(guò)Western法鑒定Shh在細(xì)胞中的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:1.采用密度梯度離心-貼壁培養(yǎng)法易獲取大鼠BMMSC,檢測(cè)結(jié)果為CD44、SH3陽(yáng)

6、性,CD45、CD34陰性。2.Western檢測(cè)證實(shí)采用電轉(zhuǎn)染法能成功地將Shh基因轉(zhuǎn)染至大鼠BMMSC中,并獲得有效的表達(dá)。
　　 結(jié)論:真核表達(dá)載體PCDNA3.1(-)-SHH可以成功地在BMMSC中表達(dá),為進(jìn)一步探討Shh基因轉(zhuǎn)染BMMSC移植對(duì)大鼠心功能及心室重構(gòu)的影響提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 第二部分:血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因轉(zhuǎn)染骨髓
　　 間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)大鼠心功能的影響
　　 目的:探討

7、Shh基因轉(zhuǎn)染BMMSC后心肌移植對(duì)缺血性心臟病心功能的影響,并比較聯(lián)合治療與基因治療、細(xì)胞治療單獨(dú)使用的療效差別。
　　 方法:采用雄性wistar大鼠,建立心梗模型四周后,隨機(jī)均衡分入Shh轉(zhuǎn)染MSC組(A組),MSC組(B組),Shh組(C組),Shh基因+MSC組(D組),注射DMEM培養(yǎng)基組(E組),共5組。再按注射后時(shí)間將各組分為1周,2周,4周,8周四個(gè)亞組,各亞組保證至少10只動(dòng)物。到各相應(yīng)時(shí)間后以Buxco系統(tǒng)

8、檢測(cè)心功能。
　　 結(jié)果:在第一周時(shí),SLVP在各組間沒(méi)有明顯差異,LVEDP則有A、B、D組低于E組,另外還有A組低于C組,其余各組相比則沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,+dp/dtmax測(cè)量值中A、C、D組高于E組,-dp/dtmax中有A、C低于E組;第二周時(shí),SLVP中以A、C、D組高于E組,LVEDP在各組間沒(méi)有差別,+dp/dtmax測(cè)量值中有A組高于D組,-dp/dtmax中有A組低于E組;第四周時(shí),A、B、C、D四組在SLVP、

9、+dp/dtmax測(cè)量值中均高于E組,而在-dp/dtmax中均低于E組,LVEDP測(cè)值中有C、D兩組低于E組;到第八周時(shí),A、B、C、D四組在SLVP、+dp/dtmax測(cè)量值中均高于E組,而在LVEDP、-dp/dtmax中則均低于E組,此外,在C組與D組的比較中,C組的SLVP、+dp/dtmax測(cè)量值均低于D組,而LVEDP、-dp/dtmax測(cè)量值均高于D組。在觀察各處理組隨時(shí)間變化心功能的變化情況時(shí),我們發(fā)現(xiàn)A、B、C、D四