白體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療下肢缺血性疾病研究.pdf

1、本研究旨在通過分析移植自體MSCs前后下肢血流灌注情況，探索其安全性、可行性，并且取得了初步結(jié)果。研究內(nèi)容分為兩部分： 第一部分：基礎(chǔ)研究。 1.研究方法： ①健康純種新西蘭大白兔26只，雌雄不限，按移植成分的不同，隨機分成3組：(1)移植轉(zhuǎn)染VEGF的MSCs組10只(以下簡稱VEGF組)；(2)移植單純MSCs組8只(以下簡稱MSCs組)；(3)移植DMEM(Dulbeco’sModifiedEagleMed

2、ium，DMEM)液組8只(以下簡稱DMEM組)。 ②抽取骨髓，進(jìn)行MSCs的體外培養(yǎng)增殖，當(dāng)細(xì)胞數(shù)達(dá)107后制成單細(xì)胞懸液供移植或轉(zhuǎn)染用。 ③用含hVEGF165的非擴(kuò)增型腺病毒轉(zhuǎn)染MSCs，細(xì)胞轉(zhuǎn)染2天后用胰蛋白酶處理制成107/ml的細(xì)胞懸液供移植用。轉(zhuǎn)染后hVEGF165的表達(dá)用RT-PCR法和Westernblot方法鑒定。同時取部分MSCs轉(zhuǎn)染GFP(greenfluorescenceprotein，GFP)

3、以熒光顯微鏡測定其轉(zhuǎn)染率。 ④缺血后肢動物模型的建立：經(jīng)腹腔注射麻醉后，將右股動脈從髂外動脈分出的起始部至腘動脈處結(jié)扎切除，30min后在股部肌肉取5點按實驗分組分別植入無細(xì)胞的DMEM液、單純傳代培養(yǎng)的MSCs、轉(zhuǎn)染hVEGF165的MSCs。 ⑤術(shù)后每周(共4周)行ECT檢測后肢血流灌注，以ECT體內(nèi)標(biāo)記紅細(xì)胞法動態(tài)測定兔缺血后肢血流灌注，取右/左后肢比值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。 ⑥統(tǒng)計學(xué)處理：數(shù)據(jù)以x±S表示，組間比

4、較采用spss11.5軟件進(jìn)行方差分析，以P＜0.05為差異有顯著性。 2.研究結(jié)果： ①MSCs轉(zhuǎn)染hVEGF165及GFP后未見細(xì)胞死亡，轉(zhuǎn)染率達(dá)95％以上，各移植組細(xì)胞懸液MSCs計數(shù)均在107以上。 ②到移植后4周，各組分別存活動物為VEGF組8只，MSCs組6只，DMEM組5只。 ③RT-PCR法：轉(zhuǎn)染hVEGF165的MSCs組在150bp處有片段表達(dá)，而轉(zhuǎn)染GFP的MSCs組及未轉(zhuǎn)染的MSC

5、s組無片段表達(dá)。Westernblot法：轉(zhuǎn)染hVEGF165的MSCs組在23KD處有目的條帶，而轉(zhuǎn)染GFP的MSCs組及未轉(zhuǎn)染的MSCs組無條帶表達(dá)。 ④術(shù)后各周的均數(shù)差異，VEGF組與DMEM組在術(shù)后1、3、4周P＜0.05，MSCs組與DMEM組在術(shù)后2、3周P＜0.05。 3.研究結(jié)論： MSCs培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染VEGF后移植治療下肢缺血是安全可行的，本實驗結(jié)果表明自體MSCs移植可以有效改善缺血下肢的血流灌

6、注，但轉(zhuǎn)染VEGF似乎并不能進(jìn)一步提高M(jìn)SCs改善缺血下肢血流灌注的效果。 第二部分：臨床研究： 1.研究方法： ①將下肢缺血患者經(jīng)動脈造影證實小腿動脈流出道不佳者作為入選對象，本組共13例。 ②髂骨處抽取自體骨髓培養(yǎng)，細(xì)胞數(shù)達(dá)107時制成單細(xì)胞懸液移植，同時取部分細(xì)胞以流式細(xì)胞儀測定其表面抗原CD117，CD29，CD166，CD45，CD34表達(dá)。 ③移植途徑：a.經(jīng)DSA/B超引導(dǎo)下經(jīng)股/腘

7、動脈內(nèi)移植；b.肌肉注射移植。 ④所有患者均被隨訪，時間為1～14個月，平均5個月。 2.研究結(jié)果： ①MSCs培養(yǎng)1例失敗，后經(jīng)骨髓檢查證實為粒系增生低下，培養(yǎng)成功12例。12例患者流式細(xì)胞儀測定其表面抗原CD117，CD29，CD166，CD45，CD34平均值各為40.7，74.7，38.6，48.4，1.90，證實為MSCs。 ②在13例共20條足部疼痛中，緩解率為80％；10條伴有小腿疼痛的下肢