羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療大鼠腦缺血再灌注損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、腦血管病是嚴(yán)重危害人類健康的疾病，其中最常見的是缺血性腦血管病，發(fā)病率占腦血管病的70％以上，常造成人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)大量神經(jīng)細(xì)胞缺失和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)受損，導(dǎo)致患者長期神經(jīng)功能障礙。腦血管疾病的治療目前無特殊有效的方法。干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展，為治療甚至治愈腦血管病提供了可能。既往以為，成年中樞神經(jīng)元一旦受到損傷而死亡，就永遠(yuǎn)不會(huì)再生。目前的研究表明，人的大腦有許多區(qū)域都存在內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞，在正常狀態(tài)下，這些內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞處于靜息狀態(tài)。一旦受到受

2、到缺血缺氧等刺激，靜息態(tài)的內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞即可發(fā)生增殖，并向缺血損傷區(qū)遷移、分化，以試圖替代受損的神經(jīng)元。但內(nèi)源性干細(xì)胞對(duì)腦組織的修復(fù)作用非常有限。這與內(nèi)源性干細(xì)胞的數(shù)量不足、缺血局部炎性微環(huán)境不利于內(nèi)源性干細(xì)胞的生長等原因有關(guān)。目前的研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)向于移植外源性神經(jīng)干細(xì)胞，其中間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells,MSCs)是目前備受關(guān)注的一類具有多向分化能力的成體干細(xì)胞，而骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bonemarrowmese

3、nchymalstemcells,BMSCs)因成功避開了胚胎干細(xì)胞來源缺乏、倫理道德、法律限制等問題，在實(shí)驗(yàn)研究中成為熱點(diǎn)。但傳統(tǒng)的取骨髓方法給患者帶來一定的痛苦，且骨髓中干細(xì)胞的數(shù)量和分化能力隨年齡的增長而降低，因此，尋找一種可替代BMSCs的種子細(xì)胞已引起了人們的關(guān)注。羊膜組織來源豐富，不存在倫理道德和法律問題，且研究表明羊膜間充質(zhì)細(xì)胞(humanamnionmembranemesenchymalstemcells,hAMSCs)

4、免疫表型與BMSCs相似，具免疫源性低、擴(kuò)增能力強(qiáng)等優(yōu)勢，是一種理想的再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的種子細(xì)胞來源。
　　 目的：
　　 建立大鼠腦缺血再灌注模型，探討不同途徑移植hAMSCs對(duì)腦缺血損傷的作用及其可能的機(jī)制；探討使用抗炎藥物以后對(duì)于改善干細(xì)胞的生長環(huán)境、促進(jìn)干細(xì)胞生長的意義。
　　 方法：
　　 (1)將胎盤組織經(jīng)酶消化和貼壁培養(yǎng)獲得的細(xì)胞，用免疫熒光標(biāo)記、流式細(xì)胞儀檢測分析其表型和神經(jīng)生物學(xué)特性。

5、>　　 (2)將hAMSCs與T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，通過3H-TdR摻入、β液閃技術(shù)分析hAMSCs對(duì)淋巴細(xì)胞、T細(xì)胞的免疫刺激作用。
　　 (3)線栓法制備大鼠腦中動(dòng)脈缺血再灌注模型，于缺血后24小時(shí)分別通過側(cè)腦室、尾靜脈移植hAMSCs，并在腦缺血后2周、4周時(shí)完成mNSS評(píng)分，免疫熒光檢測BrdU陽性細(xì)胞的表達(dá)；缺血1周時(shí)測定腦梗死體積，評(píng)價(jià)不同途徑移植的效果。
　　 (4)利用人工合成E-選擇素的抗粘附作用，觀察應(yīng)

6、用人工合成E-選擇素后，腦缺血再灌注模型大鼠腦組織及血清中炎癥因子TNF-α、IL-1β的含量變化，檢測局部微環(huán)境改善后內(nèi)外源性干細(xì)胞的表達(dá)情況生長情況。
　　 結(jié)果：
　　 (1)由胎盤分離得到的細(xì)胞具有與BMSCs相似的形態(tài)和細(xì)胞表面標(biāo)志，免疫熒光標(biāo)記和流式細(xì)胞儀檢測顯示該群細(xì)胞表達(dá)CD29、CD44、CD105，不表達(dá)CD34、CD19、CD106、HLA-DR和CD105。經(jīng)誘導(dǎo)后細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞特異性標(biāo)記物NS

7、E、GFAP。
　　 (2)hAMSCs對(duì)淋巴細(xì)胞的增殖具有抑制作用，并且隨著加入hAMSCs濃度的增加，其抑制作用越強(qiáng)；hAMSCs可抑制免疫排斥反應(yīng)中Thl型細(xì)胞的作用，降低免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生。顯示hAMSCs具有免疫調(diào)節(jié)特性。
　　 (3)不同途徑移植后，hAMSCs在局部存活分化，有效改善動(dòng)物神經(jīng)功能，側(cè)腦室移植效果好于尾靜脈移植。其作用機(jī)理可能與干細(xì)胞分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子有關(guān)。
　　 (4)應(yīng)用人工合成E-