超聲介導(dǎo)白蛋白微泡破裂促進(jìn)成纖維細(xì)胞生長因子-2轉(zhuǎn)移骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchyme stem cell，BMSCs)來源于中胚層，具有自我更新和多向分化潛能，可以體外分離培養(yǎng)，經(jīng)一定條件誘導(dǎo)，可以向心肌細(xì)胞方向分化。5-氮胞苷(5-azacytidine,5-aza)誘導(dǎo)后，可使得某些基因的肌源性決定部位去甲基化，轉(zhuǎn)錄激活，引起細(xì)胞向肌源性細(xì)胞分化。成纖維細(xì)胞生長因子-2(FGF-2)是一種有絲分裂原，具有促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖的效應(yīng)。據(jù)報(bào)道，此因子還具有

2、心臟保護(hù)作用，可以誘導(dǎo)心肌肥大，并且可以提高心肌細(xì)胞在缺氧條件下的存活率。超聲介導(dǎo)的白蛋白微泡破裂可以促進(jìn)DNA分子穿透細(xì)胞膜和核膜并整合入細(xì)胞基因組中。本研究目的：(1)體外克隆FGF-2基因，重組并構(gòu)建其真核表達(dá)載體；(2)探討B(tài)MSCs體外分離培養(yǎng)并誘導(dǎo)其向心肌細(xì)胞分化方法；(3)探討超聲介導(dǎo)白蛋白微泡破裂促進(jìn)FGF-2轉(zhuǎn)移BMSCs的方法，并和脂質(zhì)體(lipsome2000)介導(dǎo)轉(zhuǎn)移BMSCs相比較。 方法：(1)采用全

3、骨髓培養(yǎng)法和Ficoll分離法體外分離培養(yǎng)大鼠BMSCs，觀察其生長特性，表面抗原表達(dá)等，HE染色觀察BMSCs細(xì)胞形態(tài)，胞核和胞漿，MTT法分別測定誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)BMSCs的生長曲線。在第4代加入10μmol/L 5-aza預(yù)誘導(dǎo)BMSCs24小時(shí)(hr)，第7代再一次加入10μmol/L 5-aza誘導(dǎo)24hr：流式細(xì)胞儀技術(shù)、免疫熒光及RT-PCR實(shí)驗(yàn)對誘導(dǎo)前后的BMSCs進(jìn)行表型鑒定； (2)分離培養(yǎng)新生大鼠心室肌細(xì)胞，觀

4、察其體外生長的形態(tài)、特性，以及抗原表達(dá)等特征； (3)收集體外培養(yǎng)的心室肌細(xì)胞，Trizol法提取心室肌細(xì)胞總mRNA，RT-PCR克隆擴(kuò)增大鼠FGF-2基因，與PIRES2-EGFP載體連接，構(gòu)建重組PIRES2-EGFP-FGF-2真核表達(dá)載體； (4)調(diào)整超聲強(qiáng)度和作用時(shí)間，尋找最佳作用條件，在超聲介導(dǎo)白蛋白微泡破裂作用下促進(jìn)FGF-2基因轉(zhuǎn)移BMSCs，24hr后熒光顯微鏡下觀察EGFP表達(dá)情況； (5)

5、在一定劑量的lipsome2000作用下，促進(jìn)FGF-2基因轉(zhuǎn)移BMSCs； (6)臺盼藍(lán)染色法測定不同超聲強(qiáng)度不同作用時(shí)間之后BMSCs的活性； (7)流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測超聲組和脂質(zhì)體組轉(zhuǎn)移FGF-2之后報(bào)告基因EGFP的表達(dá)。 結(jié)果：(1)由新生大鼠心室肌組織分離培養(yǎng)得到心室肌細(xì)胞呈簇樣生長并重疊成致密有邊界的細(xì)胞團(tuán)，培養(yǎng)10天左右，倒置相差顯微鏡下可見成團(tuán)的心室肌細(xì)胞出現(xiàn)節(jié)律性收縮，收縮時(shí)間長達(dá)半個(gè)月之久。

6、 (2)從心室肌細(xì)胞中擴(kuò)增FGF-2基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒PIRES2-EGFP-FGF-2，測序正確的陽性克隆保種備用。 (3)由骨髓分離得到的BMSCs體外培養(yǎng)呈長梭形貼壁生長，部分造血細(xì)胞懸浮在培養(yǎng)基中，MTT生長曲線顯示，細(xì)胞在接種后第2天即進(jìn)入對數(shù)生長期，細(xì)胞增殖活躍，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞向外周伸展，兩端有軸狀突起，細(xì)胞呈長梭形，有雙核分裂相的BMSCs多見，胞核較圓，核質(zhì)豐富，核仁可見。隨著細(xì)胞生長密度增大，

7、彼此相連；7天可鋪滿瓶底，生長迅速，可大量繁殖，之后如不傳代，則有老化現(xiàn)象。12天左右，BMSCs生長緩慢，進(jìn)入平臺期。 (4)運(yùn)用免疫熒光和流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測顯示該群細(xì)胞高表達(dá)CD44(99.3％)，CD54(97.7％)，CD90(99.4％)，CD71(98.2％)，CD106(25.8％)表達(dá)相對較低，低表達(dá)CD45(8.9％)，CD31(15.9％)等造血細(xì)胞表面標(biāo)志。BMSCs經(jīng)傳代之后，細(xì)胞形態(tài)比較均一，生長速度較

8、快，平均3-4d可鋪滿瓶底，細(xì)胞接種密度較大，接觸抑制比較明顯。第10代BMSCs HE染色，細(xì)胞仍呈長梭形，兩端有軸狀突起，胞漿豐富深染成紅色，胞核圓形或橢圓形，呈藍(lán)色，核仁明顯。 (5)BMSCs經(jīng)5-aza誘導(dǎo)5天后，倒置相差顯微鏡下觀察，細(xì)胞呈集落樣生長，體積變大變圓，大小不等，核質(zhì)豐富深染，比較粗糙，胞核較圓，核仁清楚，多分裂相，增殖能力強(qiáng)，細(xì)胞之間互相交聯(lián)，緊密連接。免疫熒光染色后發(fā)現(xiàn)經(jīng)5-aza誘導(dǎo)后的BMSCs可

9、表達(dá)心肌細(xì)胞特異性分子肌球蛋白重鏈(MHC-β)、連接蛋白43(connexin43)、結(jié)蛋白(desmin)以及橫紋肌肌動(dòng)蛋白(actinin-α)：而部分經(jīng)誘導(dǎo)的細(xì)胞也表達(dá)血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性分子(Flk-1/VEGFR2/KDR)。經(jīng)RT-PCR檢測，誘導(dǎo)的BMSCs表達(dá)心肌細(xì)胞早期發(fā)育基因NKX2.5和GATA4。 (6)FGF-2基因在超聲介導(dǎo)白蛋白微泡破裂作用下轉(zhuǎn)移到BMSCs。熒光顯微鏡下可看到綠色熒光，細(xì)胞表達(dá)EG

10、FP；lipsome2000介導(dǎo)的FGF-2基因轉(zhuǎn)移大鼠BMSCs，24hr后熒光顯微鏡下觀察，可見到綠色熒光，細(xì)胞表達(dá)EGFP，F(xiàn)GF-2基因轉(zhuǎn)移BMSCs中。 (7)不同超聲強(qiáng)度和作用時(shí)間對于BMSCs活力影響不同，通過測定，在不超過0.75W/cm2的超聲強(qiáng)度，32sec的作用時(shí)間之內(nèi)，對于細(xì)胞都是安全的。0.75W/cm2為最好轉(zhuǎn)移強(qiáng)度，32sec為最好轉(zhuǎn)移時(shí)間。 (8)FGF-2轉(zhuǎn)移BMSCs 48hr后進(jìn)行流

11、式細(xì)胞儀技術(shù)測定報(bào)告基因EGFP的表達(dá)，脂質(zhì)體組報(bào)告基因EGFP表達(dá)率(49.35±9.34)％，明顯高于超聲組(30.42±4.58)％，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差(P<0.05)；脂質(zhì)體組轉(zhuǎn)移效率高于超聲組。 結(jié)論：(1)采用組織塊培養(yǎng)法，可體外成功分離培養(yǎng)新生Sprague-Dawley(SD)大鼠心室肌細(xì)胞，采用免疫熒光方法，可對表面抗原進(jìn)行鑒定。 (2)收集SD大鼠心室肌細(xì)胞，Trizol法抽提RNA，依照NCBI Geneb

12、ank中大鼠FGF-2基因序列，設(shè)計(jì)適當(dāng)引物，可克隆出大鼠FGF-2基因，并成功構(gòu)建了其真核表達(dá)載體。 (3)一定濃度的5-aza可誘導(dǎo)BMSCs向心肌細(xì)胞分化。 (4)不同超聲強(qiáng)度、不同作用時(shí)間對于BMSCs活力影響不同。 (5)脂質(zhì)體和超聲介導(dǎo)的白蛋白微泡破裂均可以促進(jìn)FGF-2轉(zhuǎn)移BMSCs。 (6)超聲介導(dǎo)白蛋白微泡破裂可促進(jìn)FGF-2轉(zhuǎn)移BMSCs，為非病毒載體進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移提供了新的方法，但轉(zhuǎn)移