星形膠質(zhì)細(xì)胞缺氧-復(fù)氧條件下EAAT2、GS的表達(dá)及亞低溫對其的影響.pdf

1、目的：觀察缺氧／復(fù)氧損傷后體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運體、谷氨酰胺合成酶的表達(dá)，以及亞低溫干預(yù)對星形膠質(zhì)細(xì)胞興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運體、谷氨酰胺合成酶的影響，探討亞低溫對腦缺血再灌注損傷的可能保護(hù)機(jī)制。
　　 方法：利用新生24小時內(nèi)的SD大鼠，取腦皮層新鮮腦組織，參照McCarthy等的方法加以改進(jìn)進(jìn)行星形膠質(zhì)細(xì)胞（astrocyte，AC）原代培養(yǎng)，調(diào)整細(xì)胞密度為1.0×105/cm2，接種到含胎牛血清培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，置

2、于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)。7-8天后傳代，傳至第3代，細(xì)胞自然純化后，采用神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(gliafibrillary acid protein，GFAP)免疫熒光鑒定AC,97％以上為陽性細(xì)胞，符合實驗要求。將AC分為正常對照組(C)、常溫缺氧／復(fù)氧組(H/R)、啞低溫缺氧／復(fù)氧組(H/M+R)。用三氣培養(yǎng)箱以95％N2、5％CO2造成細(xì)胞缺氧，記缺氧損傷時間，缺氧12小時后分別調(diào)節(jié)溫度37℃及32℃，開始記復(fù)氧時間。每組設(shè)復(fù)氧2h、4h

3、、8h、12h、24h、48h6個時間點，建立AC缺氧／復(fù)氧模型。MTT測定細(xì)胞活力，比色法測谷氨酸( Glu)濃度及谷氨酰胺合成酶(GS)的活性，Western-blot法半定量分析EAAT2、GS的表達(dá)情況，免疫熒光染色觀察EAAT2與GS表達(dá)情況。采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行資料分析。
　　 結(jié)果：1．體外純化培養(yǎng)AC及GFAP鑒定結(jié)果：AC傳至3代后，細(xì)胞突起較多而長，胞體較大而扁，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，胞核多偏于一側(cè)，

4、多為橢圓形，GFAP免疫熒光染色顯示綠色。2.MTT法檢測細(xì)胞活力：(1)C組細(xì)胞活力無明顯改變。(2)H/R組與C組比較細(xì)胞吸光度下降，細(xì)胞活力減低，隨著時間延長細(xì)胞活力下降明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。(3)H/M+R組與C組比較細(xì)胞吸光度下降，與H/R組比較明顯增加，細(xì)胞損傷減輕，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。3．比色法測定GLU濃度：分別按各時間點測定各組谷氨酸濃度結(jié)果：(1)C組細(xì)胞谷氨酸濃度未見明顯差異性交化。

5、(2)H/R組與C組比較隨著缺氧／復(fù)氧時間延長谷氨酸濃度呈現(xiàn)增多趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。(3)H/M+R組與C組比較谷氨酸濃度增多，與H/R組比較濃度則減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。4．比色法測GS活性結(jié)果：(1)C組GS活性表達(dá)無明顯異常。(2)H/R組GS活性表達(dá)與C組比較隨時間延長表達(dá)上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。H/M+R組GS表達(dá)活性上升，且較H/R組活性更高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05

6、）。5.Western-blot半定量檢測結(jié)果：(1)C組EAAT2、GS表達(dá)變化不明顯，各時間點問無統(tǒng)計學(xué)意義。(2)H/R組EAAT2表達(dá)量先減少，隨著復(fù)氧時間延長逐漸增多，與C組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；GS的表達(dá)隨著復(fù)氧時間延長，表達(dá)逐漸增多，與C組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。(3)H/M+R組EAAT2表達(dá)量先減少，隨著復(fù)氧時間延長逐漸增多，與C組相比差異有顯著性（P＜0.05），與H/R組比較表達(dá)量下降

7、趨勢減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；H/M+R組GS表達(dá)量隨著復(fù)氧時間延長，表達(dá)逐漸增多，與C組比較增多差異有顯著性（P＜0.05），與H/R組比較增高趨勢更加明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。6.GS與EAAT2免疫熒光結(jié)果：H/M+R組與H/R組比較GS表達(dá)增多，EAAT2表達(dá)下降趨勢減少；GS表達(dá)增加時EAAT2表達(dá)減弱，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：1.缺氧／復(fù)氧可以引起星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷，