TGF-β-,1- SiRNA對(duì)人胃癌細(xì)胞和腹膜間皮細(xì)胞作用意義的初步探討.pdf

1、腹膜轉(zhuǎn)移是進(jìn)展期胃癌根治術(shù)后最常見的復(fù)發(fā)形式，最終導(dǎo)致以頑固性腹水為主要特征的癌性腹膜炎，是胃癌患者最主要的死亡原因。文獻(xiàn)報(bào)道，進(jìn)展期胃癌根治術(shù)后腹膜轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)者約占40-50％。胃癌腹膜轉(zhuǎn)移存在三種途徑，其中最主要的途徑為腹腔種植性轉(zhuǎn)移。目前，國(guó)內(nèi)許多學(xué)者認(rèn)為腹膜轉(zhuǎn)移是特殊的腫瘤細(xì)胞與腹膜適宜的環(huán)境相互作用的結(jié)果，涉及粘附、降解、移動(dòng)、血管生成、免疫逃避等諸多方面，其中粘附分子、降解酶、細(xì)胞因子在腹膜轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。 腹膜是

2、由間皮細(xì)胞和彈性纖維組織構(gòu)成的漿膜組織。正常腹膜為三層結(jié)構(gòu)：表面為單層間皮細(xì)胞層，偶有缺失；其下為一薄的、連續(xù)的膠原纖維層，內(nèi)含少量基質(zhì)細(xì)胞；最下一層為脂肪組織層。扁平狀的間皮細(xì)胞呈連續(xù)排列，覆蓋于盆腹腔各壁的內(nèi)面及腔內(nèi)各器官的表面，呈半透明狀，薄而光滑，能分泌、表達(dá)多種細(xì)胞因子、粘附分子及基質(zhì)成分，是一道天然的機(jī)械防御屏障，避免間皮下組織的暴露以及微生物的侵襲。進(jìn)展期胃癌常發(fā)生腹膜轉(zhuǎn)移，而腹膜轉(zhuǎn)移是一個(gè)多階段的過程，在這個(gè)過程中，覆蓋

3、在腹膜表面的間皮細(xì)胞無疑發(fā)揮著重要的作用。其與腫瘤細(xì)胞的粘附是胃癌腹膜種植轉(zhuǎn)移形成的關(guān)鍵。建立合適的間皮細(xì)胞體外培養(yǎng)方法和體外侵襲模型無疑是必要的。 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β最初是由Roberts等在1981年作為一個(gè)可誘導(dǎo)大鼠成纖維細(xì)胞增殖的因子描述的，它包括5個(gè)亞型，成熟的TGF-β1是由112個(gè)氨基酸亞單位通過二硫腱形成的二聚體多肽，分子量約為25KD，具有多種生物學(xué)效應(yīng)，在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、細(xì)胞外基質(zhì)形成、細(xì)胞移動(dòng)、粘附、腫瘤轉(zhuǎn)

4、移等方面具有重要作用。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子是纖維化過程的重要調(diào)節(jié)因子，是腹膜纖維化的中心環(huán)節(jié)。幾乎所有腫瘤均能分泌TGF-β1，其通過增加基質(zhì)成分和降低蛋白酶活性來增加粘附能力，如TGF-β1刺激小鼠乳腺癌細(xì)胞可以增強(qiáng)其侵襲轉(zhuǎn)移的能力。人類腫瘤患者TGF-β1表達(dá)增強(qiáng)往往預(yù)示腫瘤患者預(yù)后不良。TGF-β1在促進(jìn)胃癌腹膜轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。其參與腹膜轉(zhuǎn)移的途徑可能有：(1)TGF-β1可使間皮細(xì)胞變形，彼此之間離散易脫落，同時(shí)使間皮細(xì)胞分泌的

5、Ⅰ、Ⅲ型膠原增多，導(dǎo)致腹膜纖維化；(2)TGF-β1可使胃癌細(xì)胞表達(dá)的粘附分子如CD44表達(dá)增多；(3)TGF-β1可以抑制腹腔內(nèi)淋巴細(xì)胞活性使其無法有效的殺傷腹腔內(nèi)游離癌細(xì)胞等。 RNA干擾(RNAinterference，RNAi)是近年來人類最重大的發(fā)現(xiàn)。RNA干擾和連于被剪接的mRNA分子外部的剪接指導(dǎo)順序是利用RNA抑制人類細(xì)胞的重要手段。RNAi是由雙鏈RNA分子介導(dǎo)的序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因靜默過程，為雙鏈RNA分子在

6、mRNA水平上關(guān)閉相關(guān)基因表達(dá)的過程，是一項(xiàng)新興的基因阻斷技術(shù)。目前公認(rèn)的RNAi作用機(jī)制為：生物體細(xì)胞內(nèi)的雙鏈RNA被Dicer酶識(shí)別并切割，生成21～23nt的siRNA。這種siRNA與一系列核酸酶形成的復(fù)合物叫做RNA介導(dǎo)的靜默復(fù)合物(RNAinducedsilencingcomplex，RISC)，復(fù)合物中包括解旋酶和核酸內(nèi)切酶。解旋酶將siRNA雙鏈解開轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨男问剑c靶序列mRNA互補(bǔ)的siRNA稱為反義siRNA。反

7、義siRNA介導(dǎo)該活化復(fù)合物識(shí)別并結(jié)合與其特異性互補(bǔ)的mRNA，最終引導(dǎo)核酸內(nèi)切酶將靶序列的mRNA切成碎片而發(fā)揮作用。 基于高表達(dá)TGF-β1與腹膜轉(zhuǎn)移或腹膜轉(zhuǎn)移相關(guān)因素關(guān)系密切，RNA干擾技術(shù)可高效、特異地抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞的相應(yīng)基因表達(dá)，本研究自行構(gòu)建能在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄出功能性siRNA的載體，并將其用于干擾人胃癌細(xì)胞株SGC-7901和人腹膜間皮細(xì)胞，研究TGF-β1小干擾RNA對(duì)二者生物學(xué)行為的影響及其在腹膜轉(zhuǎn)移基因治療上的