TGF-β1 shRNA對白蛋白致人腎小管上皮細(xì)胞增殖、CTGF、TGF-β1及FN分泌的影響.pdf

1、腎間質(zhì)纖維化是各種慢性腎臟疾病進(jìn)展到終末期的共同病理改變。越來越多的臨床及動物試驗(yàn)顯示間質(zhì)纖維化、小管萎縮的程度與腎小球?yàn)V過率下降及腎功能的改變存在明顯的正相關(guān)，因此較之腎小球的病理改變，腎小管間質(zhì)病變被認(rèn)為是決定預(yù)后更為重要的因素。腎小球性蛋白尿能通過多種機(jī)制誘發(fā)及加重腎間質(zhì)纖維化。而白蛋白對小管上皮細(xì)胞的激活是間質(zhì)炎癥反應(yīng)啟動和纖維化發(fā)生的重要因素之一。其中，轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factorβ，T

2、GFβ)的過度表達(dá)已被公認(rèn)為與間質(zhì)纖維化發(fā)生和形成有密切的關(guān)系。TGF-β的下游效應(yīng)因子之一結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)介導(dǎo)轉(zhuǎn)化生長因子的部分生物活性。但人白蛋白對腎小管上皮細(xì)胞CTGF的作用未見文獻(xiàn)報道，且目前仍缺乏一種較為理想的方法抑制腎小管上皮細(xì)胞中TGF-β1的過度表達(dá)。 近幾年來，基于RNA干擾現(xiàn)象而產(chǎn)生出功能缺陷表型的新技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，并且與基因敲除等技術(shù)

3、相比體現(xiàn)出了相當(dāng)?shù)膬?yōu)越性，從而展現(xiàn)出非常廣闊的應(yīng)用前景。RNA干擾能通過導(dǎo)入與目標(biāo)基因具有同源序列的短雙鏈RNA(小干擾RNAs，siRNAs)或短發(fā)夾狀RNA(shRNA)特異性的抑制靶基因表達(dá)。基于以上原理，本實(shí)驗(yàn)首先觀察人白蛋白對腎小管上皮細(xì)胞增殖、TGF-β1、 CTGF、FN表達(dá)的作用，然后采用本研究所前期研究已構(gòu)建的兩個表達(dá)TGF-β1 shRNA的質(zhì)粒(pcDU6-Al-A2和pcDU6-B1-B2)轉(zhuǎn)染小管上皮細(xì)胞，觀

4、察其對人白蛋白刺激下小管上皮細(xì)胞增殖，TGF-β1、CTGF和 FN的影響。 目的：利用已構(gòu)建的TGF-β1 shRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人腎小管上皮細(xì)胞，觀察其對于白蛋白誘導(dǎo)下腎小管上皮細(xì)胞在細(xì)胞增殖活化，TGF-β1，CTGF，及FN方面的影響。 方法：體外培養(yǎng)人腎小管上皮細(xì)胞(HK2)，采用脂質(zhì)體2000將表達(dá)TGF-β1 shRNA的pcDU6質(zhì)粒載體(pcDU6-A1-A2和pcDU6-B1-B2)轉(zhuǎn)染入試驗(yàn)組細(xì)胞。

5、使用人血清白蛋白(5g／1)刺激HK2細(xì)胞12及24小時，用四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法測定細(xì)胞增殖；HK2細(xì)胞中TGF-β1、和FN mRNA的表達(dá)水平采用半定量RT-PCR檢測，培養(yǎng)液中TGF-β1及FN蛋白質(zhì)水平采用雙抗夾心法ELISA檢測。5g／l白蛋白刺激HK2細(xì)胞12小時，細(xì)胞中CTGFmRNA的表達(dá)水平采用半定量RT-PCR檢測。 結(jié)果：白蛋白(5g/l)分別干預(yù)HK2細(xì)胞12及24小時，與1640對照組比較均可

6、促進(jìn)HK2細(xì)胞增殖(p<0.05)，且作用24小時組更明顯；TGF-β1shRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染組，較之pcDU6空載體組，HK2細(xì)胞增殖被抑制(p<0.05)。在白蛋白(5g/1)分別刺激12小時及24小時后，細(xì)胞中TGF-β1和FN mRNA的表達(dá)及培養(yǎng)液中TGF-β1和FN的蛋白質(zhì)表達(dá)水平均明顯升高，(p<0.05)在白蛋白(5g/1)刺激12小時，CTGFmRNA的表達(dá)增加；TGF-βlshRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染組較pcDU6空載體組

7、明顯下調(diào)TGF-β1及FN的基因表達(dá)(p<0.05)，細(xì)胞培養(yǎng)液中，TGF-β1和FN的蛋白質(zhì)水平明顯下降，CTGFmRNA的表達(dá)亦下降。兩TGF-β<,1>shRNA干擾組間比較，以及pcDU6空載體轉(zhuǎn)染組與白蛋白刺激組比較，在細(xì)胞增殖、TGF-β<,1>、CTGF及FN表達(dá)方面無顯著差異(P>0.05)。 結(jié)論：人白蛋白刺激可促進(jìn)HK2細(xì)胞增殖、上調(diào)細(xì)胞TGF-β<,1>、CTGF及FN mRNA表達(dá)，并致細(xì)胞TGF-β<,