TGF-β1 shRNA對白蛋白致人腎小管上皮細胞增殖、CTGF、TGF-β1及FN分泌的影響.pdf

1、腎間質(zhì)纖維化是各種慢性腎臟疾病進展到終末期的共同病理改變。越來越多的臨床及動物試驗顯示間質(zhì)纖維化、小管萎縮的程度與腎小球濾過率下降及腎功能的改變存在明顯的正相關(guān)，因此較之腎小球的病理改變，腎小管間質(zhì)病變被認為是決定預(yù)后更為重要的因素。腎小球性蛋白尿能通過多種機制誘發(fā)及加重腎間質(zhì)纖維化。而白蛋白對小管上皮細胞的激活是間質(zhì)炎癥反應(yīng)啟動和纖維化發(fā)生的重要因素之一。其中，轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factorβ，T

2、GFβ)的過度表達已被公認為與間質(zhì)纖維化發(fā)生和形成有密切的關(guān)系。TGF-β的下游效應(yīng)因子之一結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)介導(dǎo)轉(zhuǎn)化生長因子的部分生物活性。但人白蛋白對腎小管上皮細胞CTGF的作用未見文獻報道，且目前仍缺乏一種較為理想的方法抑制腎小管上皮細胞中TGF-β1的過度表達。 近幾年來，基于RNA干擾現(xiàn)象而產(chǎn)生出功能缺陷表型的新技術(shù)應(yīng)運而生，并且與基因敲除等技術(shù)

3、相比體現(xiàn)出了相當?shù)膬?yōu)越性，從而展現(xiàn)出非常廣闊的應(yīng)用前景。RNA干擾能通過導(dǎo)入與目標基因具有同源序列的短雙鏈RNA(小干擾RNAs，siRNAs)或短發(fā)夾狀RNA(shRNA)特異性的抑制靶基因表達?；谝陨显恚緦嶒炇紫扔^察人白蛋白對腎小管上皮細胞增殖、TGF-β1、 CTGF、FN表達的作用，然后采用本研究所前期研究已構(gòu)建的兩個表達TGF-β1 shRNA的質(zhì)粒(pcDU6-Al-A2和pcDU6-B1-B2)轉(zhuǎn)染小管上皮細胞，觀

4、察其對人白蛋白刺激下小管上皮細胞增殖，TGF-β1、CTGF和 FN的影響。 目的：利用已構(gòu)建的TGF-β1 shRNA表達載體轉(zhuǎn)染人腎小管上皮細胞，觀察其對于白蛋白誘導(dǎo)下腎小管上皮細胞在細胞增殖活化，TGF-β1，CTGF，及FN方面的影響。 方法：體外培養(yǎng)人腎小管上皮細胞(HK2)，采用脂質(zhì)體2000將表達TGF-β1 shRNA的pcDU6質(zhì)粒載體(pcDU6-A1-A2和pcDU6-B1-B2)轉(zhuǎn)染入試驗組細胞。

5、使用人血清白蛋白(5g／1)刺激HK2細胞12及24小時，用四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法測定細胞增殖；HK2細胞中TGF-β1、和FN mRNA的表達水平采用半定量RT-PCR檢測，培養(yǎng)液中TGF-β1及FN蛋白質(zhì)水平采用雙抗夾心法ELISA檢測。5g／l白蛋白刺激HK2細胞12小時，細胞中CTGFmRNA的表達水平采用半定量RT-PCR檢測。 結(jié)果：白蛋白(5g/l)分別干預(yù)HK2細胞12及24小時，與1640對照組比較均可

6、促進HK2細胞增殖(p<0.05)，且作用24小時組更明顯；TGF-β1shRNA表達載體轉(zhuǎn)染組，較之pcDU6空載體組，HK2細胞增殖被抑制(p<0.05)。在白蛋白(5g/1)分別刺激12小時及24小時后，細胞中TGF-β1和FN mRNA的表達及培養(yǎng)液中TGF-β1和FN的蛋白質(zhì)表達水平均明顯升高，(p<0.05)在白蛋白(5g/1)刺激12小時，CTGFmRNA的表達增加；TGF-βlshRNA表達載體轉(zhuǎn)染組較pcDU6空載體組

7、明顯下調(diào)TGF-β1及FN的基因表達(p<0.05)，細胞培養(yǎng)液中，TGF-β1和FN的蛋白質(zhì)水平明顯下降，CTGFmRNA的表達亦下降。兩TGF-β<,1>shRNA干擾組間比較，以及pcDU6空載體轉(zhuǎn)染組與白蛋白刺激組比較，在細胞增殖、TGF-β<,1>、CTGF及FN表達方面無顯著差異(P>0.05)。 結(jié)論：人白蛋白刺激可促進HK2細胞增殖、上調(diào)細胞TGF-β<,1>、CTGF及FN mRNA表達，并致細胞TGF-β<,