nogo-66融合蛋白的原核表達及鑒定

1、· 2 5 6 ·免 疫 學 雜 志 第 2 l 卷 第 3 期 2 0 0 5 年 5 月I M M U N O L O G I C A LJ O U R N A LV o 1 ． 2 1N o ．3M a y2 0 0 5[ 文章編號] 1 0 0 0 ． 8 8 6 1 ( 2 0 0 5 ) 0 3 — 0 2 5 6 — 0 3N o g o ． 6 6融合蛋白的原核表達及鑒定 謝 琳h ， 賀翔鴿h ，

2、蘇踴躍 ， 陳渝 ， X i n — f uZ H O U 2 ( 1 ． 第三軍醫(yī)大學 a ． 大 坪醫(yī)院眼科， 重慶4 0 0 0 4 2 ；b ． 西南醫(yī)院全軍燒傷研究所， 重慶 4 0 0 0 3 8 ； 2 ． 澳大利亞 Hi n d e r s 大學人 類生理 學系神經(jīng)科 學中心 ， 阿德萊德 ，南澳大利亞 5 0 0 1 )[ 摘 要]目的 原核表達軸突再生抑制蛋白N o g o - 6 6 ， 并對其進行鑒定。方法 采用

3、聚合酶鏈反應(yīng)方法從含 N o g o - 6 6 編 碼序列的質(zhì)粒 D N A中擴增出 N o g o - 6 6 基因開放閱讀框， 構(gòu)建原核表達載體， 轉(zhuǎn)化大腸桿菌 ， 異丙基 p D ． 硫代半乳糖苷( I P T G ) 誘 導表達， 裂解細菌抽提蛋白， 表達產(chǎn)物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳( S D S - P A G E ) 、 We s t e r n 免疫印跡鑒定。結(jié)果 測序鑒定 N o g o - 6 6開放閱讀框成功插入

4、p E T - 4 6． E K ／ L I C 質(zhì)粒； 重組質(zhì)粒在大腸桿菌中成功表達大鼠 N o g o - 6 6蛋白， S D S - P A G E測定其相對分子質(zhì) 量() 約 70 0 0 ， W e s t e r nB l o t 結(jié)果證實表達產(chǎn)物融合有聚組氨酸標簽。結(jié)論 應(yīng)用原核表達系統(tǒng)成功表達了 N o g o - 6 6 蛋白， 為 下一步制備 N o g o - 6 6 蛋白疫苗及疫苗功能研究打下了基礎(chǔ)。[ 關(guān)鍵詞

5、] N o g o - 6 6 ； 原核表達； 融合蛋白[ 中圖分類號] R 3 1 8[ 文獻標識碼] AI d e n t i f i c a t i o na n dp r o k a r y o t i ce x p r e s s i o no fNo g o - 6 6X I EL i n h ， H EX i a n g ． g e h ， S UY o n g ． y u e，C H E NY u， X i n ． f

6、uZ H O U( 1 a ． D e p a r t m e n to fO p h t h a l m o l o g y ，D a p i n gH o s p i t a l ， l b ． S t a t eK e yL a b o r a t o r yo f T r a u m a ， B u r n sa n dC o m b i n e dI n j u r y， I n s t i t u t eo fB u r n

7、 s ， S o u t h w e s th o s p i t a l ，T h i r dMi l i t a r yM e d i c a lU n i v e r s i t y ，C h o n g q i n g4 0 0 0 4 2 ，C h i n a ； 2 ．D e p a r t m e n to f H u m a nP h y s i o l o g ya n d C e n t r ef o rN e

8、u r o -s c i e n c e ， F l i n d e r sU n i v e r s i t yo f S o u t hA u s t r a l i a ， A d e l a i d e5 0 0 1 ， A u s t r a l i a)[ A b s t r a c t ]O b j e c t i v eT oe x p r e s sa n di d e n t i f yr a tN o g o -

9、6 6p e p t i d ei nE ． c o l i ． Me t h o d sT h eo p e nr e a d i n gf r a m eo fr a tN o g o - 6 6w a sa m p l i f i e db yP C R u s i n gD NAv a c c i n ea sp l a t e ．t h e ni tWa s i n s e r t e d i n t oP E T -

10、4 6 一 E K ／ L I Cv e c t o r ．R e c o mb i n a n tp l a smi dW a s i d e n t i f ie d b yc do n yP C Ra ndt r a n s f o r m e d i n t oB L 2 1 ( D E 3 )p L y s S ， a ndt h e ni n d u c e d b yI F F Gi n3 7℃ i n c u b

11、 a t i o n ． 1 h ee x p r e s i o np r o d u c tw a s a na l y z e db yS D S -P A G Ea n dW e s t e r nb l o t t i n g ．Re s u l t sT h er e c o mb i n a ntp l a s mi dW a s c o n s t r u c t e d s u c c e s s f u l

12、l y ，a ndt he nv e r i f i e d b ys e q u e n c i n g ．T h ee x p r es s e dp r o t e i n s i nE ． c o l ima i n l ye x i s ti ns u p e ma t a n t ．T h eNo g o - 6 6f u s i o np r o t e i no fM 70 0 0W a s c h a r a

13、c t e r i z e db y6×h i st a g ．Co n c l u s i o nR a tN o g o - 6 6p r o t e i ni ss u c c e sf u l l ye x p r e s s e di nE ． c o l is y s t e m，w h i c hp a v e sawa yf orp r ep a r a t i o no fv a c c i n ef orN

14、o g o - 6 6a n df orr e l a t e d f u n c t i o nr e s e a r c h．1 K e yw o r d s ] N o g o - 6 6 ； P r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n ； F u s i o np r o t e i n成年哺乳動物 外周神經(jīng) 系統(tǒng)損傷后 可有效再 生 ， 但中樞神經(jīng)系統(tǒng) ( C N S ) 損傷后 ， 受

15、損 神經(jīng)元軸突 的再生能力卻極 為有 限， 主要原 因是 由于髓磷脂抑 制物 ( M y e l i ni n h i b i t o r s ) 的存在 ， 這些分子均能誘導生 長錐塌陷， 從而導致軸突再生失敗 。2 0 0 0 年 ， 美 國、英國、 瑞士的 3 個實驗室同時克隆出 N o g o 基 因—— 抑制受損神經(jīng)再生 的基 因， 為中樞神經(jīng)損傷修 復的研究 帶 來 了 突 破 性 進 展 - 3 1 。N o g o的

16、3個 異 構(gòu) [ 收稿日 期] 2 0 o 4 —1 2 — 3 1 ； [ 修回日 期] 2 0 0 5 ～ 0 3 — 0 4[ 基金項目] 重慶市科委 自然科學基坌資助項目( C S T C ， 2 0 0 4 B B 5 0 3 2 )[ 作者簡介] 謝 琳( 1 9 6 6 一) ， 女， 重慶市人， 副教授、 副主任 醫(yī)師， 博 士生， 主要從事白內(nèi)障、 青光眼視神經(jīng)保護方面的研究。() 0 2 3 ． 6 8 7 5 7

17、3 4 1 ；( E ． m a i l ) x i e l i n 7 9 3 @s o h u ． c o Ⅱ l體 ( N o g o ． A、 N o g o ． B 、 N o g o ． C ) 中都可 檢測到一個 完全 獨立的具有抑制活性 的結(jié)構(gòu)域 N o g o ． 6 6 。針對 N o g o蛋 白的生物學功能 ， 以拮抗 N o g o 蛋 白為出發(fā)點 的神 經(jīng)再生研究近年逐漸增多， 本研究擬應(yīng)用 p E T (

18、P l a s ．m i df o rE x p r e s s i o nb yT 7R N Ap o l y m e r a s e ) 系統(tǒng)對 N o g o ．6 6 進行原核表達， 將 表達 出的 目的蛋 白進行分析鑒 定， 為下一步制備 N o g o ． 6 6 蛋白疫苗及疫苗功能研究 打下基礎(chǔ)。1 材料 與方法 1 ． 1 質(zhì)粒和試劑 疫苗質(zhì)粒( p D N Av a c c i n e ) 為澳大 利亞 H i n d

19、 e r s 大學周新富教授惠贈 ， 含有大 鼠 N o g o ．6 6 全長 c D N A序列 ， P y r o b e s tD N A聚合酶購 自T a k a r a公 司， 凝膠 回收試劑盒和質(zhì)粒抽提試劑盒為 O m e g a維普資訊 http://www.cqvip.com 2 5 8免 疫 學 雜 志 第 2 1 卷 M ) Mc M a r kp r ot e i nn x a r k e , ；1 ) L ?

20、 ~t etELw i f i , Wr G lt l o n ； 2 )IIErw I I k【 I P lL n“ } l 哪 田 3W e s i e r n ( 3 l o t 鑒 定表達產(chǎn)插 E3D e l e c t i o no fe x p r e s s i o np “ dL l n b yWe s t e r n b h ： l t t i n g明確的髓磷脂抑制物有 M A G ( M y e l i n ．

21、 a s s o c i a t , ： x lg l y c ~ 一p mt e i n ) 、 O M g p( O [ i g C N l e n d mc y U e — m y e l i n() p r o t e i n ) 、N ( t g o 等． 這些分子均能誘導生長錐塌陷，從而導致 軸突再生失敗 ． N o g t有 3個異構(gòu)體 ( N o一 A 、 N · 輯 B 、 N o 印 一 c ) ， 主要

22、分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng) 白質(zhì)中， 在髓 鞘和培養(yǎng)的少突膠質(zhì)細胞中可以檢測到， 它們可以使生長錐塌陷并抑制神經(jīng)生長一N o g o 蛋 白碳端和氮端在膜內(nèi)． 中段6 6個氨基酸殘基形成膜外的拓撲結(jié) 構(gòu)， 該段拓撲結(jié)構(gòu)是 N o g o 蛋白神經(jīng)抑制活性的結(jié)構(gòu) 基礎(chǔ) ． 研究人員將其命名為： N o g o 一 6 6。率研究采用 p E T系統(tǒng) 對 N o g o - 6 6片段進行表 達， 該系統(tǒng)是目前直用最為廣泛的原核表達系統(tǒng)之 一當 目

23、的基因被克隆到表達載體 上后． 受 噬菌體 T 7強轉(zhuǎn)錄及翻譯 信 號 控制 ， 在 [ P T G充分誘導 下， 幾 乎所有細胞都可 應(yīng)用 于表 達 目的蛋 白我們 應(yīng)用 P C R方 法 ， 以 c 1 ) N Av a ~ ． ~ , i n e為 模 板， 成 功 擴增 了N o g o - 6 6 編碼區(qū)序列， 插入原核表達載體p E T4 6 E K ／U C ， 轉(zhuǎn)化表達宿主菌 B I ． 2 l ( ~ D F 2 ,

24、) p L Y s S ， 在 1 P T ℃誘 導下， 獲得 約 70 0 0的小分子多豚 同時發(fā)現(xiàn)．原桉表達獲得的 N o g o - 6 6 蛋自主要以可溶性方式存 在于表達細菌的上清液和細胞質(zhì)中，超聲破碎細菌 后， 裂解液中可以檢測到較高水平的目的蛋白， 結(jié)合 分子質(zhì)量和抗 聚組氨酸抗體免疫反應(yīng)特異性 ， 可 認為該蛋白為 N o6 6 多肽 胞質(zhì)表達 的可溶 性蛋 白通常具有天然構(gòu)象與活性 ． 為下游多肽的功能分 析以及神經(jīng)

25、保護實驗研究奠定 r基礎(chǔ)、[ 參考文獻][ 1I(nM s ． H 1 ]r ^ B ． v l t n { k 1 ． H a a tM E ． e l {、 ‘¨ _ A；at u y e f i n - a s s ~ x ' i a t e dn e u r i t e。 u t g _ T j n 1 hi n h i l f i l o ra nc Ia na mi g e nrr r t o n o c

26、] o la n t i F x x t yI N - 】 JJ ．N a t u r e ． 2 1 1 3 0 ．4 0 3t 67 6 8 ) ：4 3 4—4 3 92 ( ； r a n d P r eT．Na km蛐 F ．、 1 a r t ar f i a nT，e t¨．- n t ／ f i [ a t i o , io ft h eN o g oi n h i b i t o rn f ~ X U [ L

27、r e g ． e n e r a t [ o n㈣ R e t i ~ u l o nrt e l n[ J ] N a l t t r e ． 2 0 ( 1 0 ． 4 0 3c 67 6 8： 4 3 9 一．1 3 ] ( k , l d h e ． r gJ 1． B a r r e sB A、 I _li nIr Y, ' e ． g er t e r a t i 一 ?JN a t u r e ， 2 O 0 0

28、 ， 4 0 3 ( 67 6 8 ) ： 3 6 9 —3 7 0 ．[ 4 ] S a m h r o ： , kJ ． R u sD W， R u s ~ L 【 I ) M o l e c u l a rC l ~ n J n g ： AL a b o r a t o ~M a n u a ll MJ ． 3 r do l i t i , ir lU S A ： L ¨ 9 Jc IS p r i n gI {一b o

29、 rL a b o r a t o r yP．舢 ： 8 8 0—8 9 4[ 5H u a ~ gD W． 、 1 c K e r m c h e rl 1B r a u nP E ．口 ， ． Af l l e r aF ~ u t i <a (i n ep fh【 I Js t i m u l a t ea¨ lr e ~ e n e r a t h , ni nt h ea d u hm a n m ~ a i

30、i a ns pIo n t 【 I ． N e u r o n1 9 9 9 ， 2 4 l3J ： 6 3 9 —6 4 7 ．[ 6” a sP S ． C l n t k a r aR K ． P E q “ ~ 4 ／ 1 1 IS P E L q “ l i i 【 I 1 ．r r n T 1 a ；-n v e n to fl “ n gc( 一[ J ] ( ' u r rO p i nP u l mM e d

31、 ， ~ X E ' 2 ． 8 ( 4 ) ：2 5 7—2 6 4．( 編輯 羅承麗)歡迎郵購 2 0 0 4 年《 免疫學雜志》 增刊《 免疫學雜志~ 2 0 0 4 年增- T I 】 ， 為 A 4 開本 1 7 5頁， 內(nèi)客豐富， 信息量大， 以綜述為主 ， 并有少量論著 其主要 介紹近年來免疫學及其相關(guān)學科研究的最新進展， 適合免疫學及相關(guān)學科的研究人 、 醫(yī)務(wù)工作者、 在校本 科生、 研 究生參閱每本 3 0元(

32、 含郵資)另騙輯部存 有部分 2 0 0 0 、 2 0 0 I 、 2 0 0 2和 2 0 0 3 年增刊， 2 0 0 0 年每本l 7 元， 2 0 0 1 年每本 2 3 元， 2 0 0 2 年每本 3 0 元， 2 0 0 3 年每本 3 O 元( 以上介格均含郵資) ． 欲購者， 請從郵局匯款，編輯部收款后 即可寄書和收據(jù) ． ． 匯款時務(wù)必注明郵購哪年增刊郵購地址： 重慶市沙 t 壩 區(qū)高灘巖《 免疫學雜志》 編輯部