圓錐動脈干畸形患兒TGFβ2基因序列分析及表達水平的研究.pdf

1、先天性心臟?。ê喎Q先心?。┦俏覈鴥和畛Ｒ姷某錾毕莶≈?，全球發(fā)病率約為9/1000，在我國已成為先天畸形的首位病種。圓錐動脈干畸形是一類由于流出道發(fā)育異常導致的先天性心血管畸形，占全部先心病的30％，包括法洛四聯(lián)癥、右室雙出口、大動脈轉位、永存動脈干、肺動脈閉鎖等，可以導致新生兒時期出現低氧血癥和難以糾正的酸中毒，自然預后不佳。部分患兒經過外科手術糾治后仍將存在一系列殘余問題，從而影響患兒的生活質量，并且給社會和家庭帶來較大的經濟和

2、精神負擔。
　　目前，普遍的觀點認為先心病是內在遺傳易感因素和外界環(huán)境致畸因素共同作用的結果。隨著分子生物學的不斷發(fā)展，包括TGFβ2在內的遺傳易感基因成為研究熱點。TGFβ2是高度保守TGFβ超家族成員之一，具有多種生物學作用。基因敲除的小鼠會導致心臟出現包括右室雙流出道、房室管畸形等多種圓錐動脈干畸形，在維甲酸處理的小鼠胚胎中，內源性TGFβ2表達降低，小鼠心臟出現流出道隔發(fā)育異常。Kubalak等研究發(fā)現，RXRA敲除小鼠中

3、TGFβ2表達升高，使得細胞凋亡增加，從而導致胚胎出現流出道發(fā)育的異常。推測TGFβ2基因很可能是圓錐動脈干畸形的致病易感基因。然而，盡管動物實驗結果顯示TGFβ2基因與心臟的畸形發(fā)育有密切的相關性，但是人類圓錐動脈干畸形與TGFβ2基因的相關研究還非常有限。
　　本課題擬研究TGFβ2基因在圓錐動脈干畸形患兒中的基因型，探尋可能導致圓錐動脈干畸形發(fā)生的突變或者單核苷酸多態(tài)性，以及分別從轉錄和翻譯水平探究TGFβ2基因在圓錐動脈干

4、畸形患兒流出道組織中的表達水平，并且與正常流出道組織中TGFβ2基因表達水平相比較，探討TGFβ2基因與人類圓錐動脈干畸形發(fā)生的關系，為進一步深入研究圓錐動脈干畸形的發(fā)生機制提供實驗依據和立論基礎。
　　第一部分圓錐動脈干畸形患兒TGFβ2基因編碼區(qū)DNA序列分析
　　目的:
　　通過對圓錐動脈干畸形患兒TGFβ2基因外顯子編碼區(qū)序列的檢測，探尋可能存在的導致疾病發(fā)生的基因變異，明確TGFβ2基因是否為圓錐動脈干畸形發(fā)

5、生的遺傳易感基因及其變異位點。
　　方法:
　　應用PCR技術以及測序方法，選取400例確診為圓錐動脈干畸形的患兒的外周血，檢測TGFβ2基因外顯子編碼區(qū)序列，分析編碼區(qū)序列的改變并探尋這些改變與圓錐動脈干畸形發(fā)生的關系。
　　結果:
　　入選的400例圓錐動脈干畸形病人診斷分類包括法洛四聯(lián)癥、左室雙流出道、右室雙出口、大動脈轉位和肺動脈閉鎖。對TGFβ2基因外顯子編碼區(qū)序列檢測，400例圓錐動脈干畸形患兒血樣中

6、有一例存在一個雜合變異c.597T＞C，此種變異位于第四外顯子，但是沒有引起所編碼氨基酸的改變，仍然為異亮氨酸，我們在UCSC數據庫中并未查到此種變異，認為其為新發(fā)現的同義突變。
　　小結:
　　在400例圓錐動脈干畸形患兒TGFβ2基因外顯子編碼區(qū)序列檢測中，發(fā)現1例患兒存在一個同義突變，即c.597T＞C，編碼的氨基酸仍然為異亮氨酸。因此認為， TGFβ2基因編碼區(qū)突變不是出生后兒童圓錐動脈干畸形發(fā)生的常見原因。

7、　　第二部分圓錐動脈干畸形患兒心臟流出道組織TGFβ2基因mRNA表達水平檢測
　　目的:
　　觀察TGFβ2基因mRNA在圓錐動脈干畸形患兒心臟流出道組織的表達水平，并比較與正常兒童表達量的差異，探討TGFβ2基因表達水平對人類心臟發(fā)育的影響。同時檢測正常胎兒心臟組織TGFβ2基因的表達水平，探尋TGFβ2基因在人類心臟發(fā)育過程中的表達特點。
　　方法:
　　選取圓錐動脈干畸形患兒心肌流出道組織57例作為病例組

8、，由5例正常兒童流出道心肌組織和13例成人流出道心肌組織作為對照組;20例胎兒正常心臟組織應用于研究TGFβ2基因在人類心臟發(fā)育過程中的時序表達特點。所有組織經過RNA提取，應用real-time PCR檢測TGFβ2基因在人類心臟中的表達水平，運用Mann-Whitney檢驗，認為P＜0.05時差異具有統(tǒng)計學意義。
　　結果:
　　1.TGFβ2基因mRNA表達在圓錐動脈干畸形患兒心肌組織中與正常對照中比較，其表達差異無統(tǒng)

9、計學意義。
　　2.TGFβ2基因mRNA在胎兒正常心臟組織中表達量明顯高于出生之后的圓錐動脈干畸形患兒和正常對照。
　　3.TGFβ2基因mRNA在胎兒正常心臟中的表達水平，呈現出隨著胎齡的逐漸增大，表達水平逐漸降低的負相關趨勢。
　　小結:
　　1.TGFβ2基因mRNA表達水平在病例組和對照組中并無明顯差異。由于TG邛超家族成員具有相似的分子結構、表達方式和生物學作用模式，各亞型之間可發(fā)揮一定補償作用，提示

10、TGFβ2基因對圓錐動脈干畸形的產生機制并不是發(fā)生在轉錄環(huán)節(jié)。本部分結果不能證明TGFβ2與人類CTD的發(fā)生具有明顯的關系。
　　2.明確TGFβ2在人類心臟發(fā)育過程中呈現一種時序性表達方式:TGFβ2基因表達在胚胎發(fā)育中明顯高于出生之后，且表達量與胎齡呈負相關趨勢，出生后的表達量維持在一定水平。
　　第三部分圓錐動脈干畸形患兒心臟流出道組織TGFβ2基因蛋白表達水平檢測
　　目的:
　　觀察TGFβ2基因蛋白在

11、圓錐動脈干畸形患兒心臟流出道組織的表達水平，并比較與正常兒童表達量的差異，探討TGFβ2蛋白表達水平在圓錐動脈干畸形發(fā)生過程的作用機制。
　　方法:
　　選取12例圓錐動脈干畸形患兒和3例正常兒童心肌流出道組織作為研究對象，運用免疫組化方法檢測TGFβ2基因蛋白質表達水平的差異。
　　結果:
　　本研究顯示，在人類心肌組織中，TGFβ2基因蛋白質的表達水平在病例組與正常對照組中無明顯差異。
　　小結: