小麥TaPP2C59基因的克隆與表達(dá)分析.pdf

1、蛋白質(zhì)的可逆磷酸化是生物信號(hào)級(jí)聯(lián)傳遞的重要方式之一,是由蛋白激酶與蛋白磷酸酶共同參與完成的。蛋白質(zhì)的磷酸化與去磷酸化反應(yīng)對(duì)于信號(hào)的快速、精確傳遞起著無(wú)可替代的作用,是細(xì)胞內(nèi)的重要調(diào)節(jié)機(jī)制,廣泛參與植物的生長(zhǎng)、發(fā)育、增殖、分化等生命活動(dòng)。蛋白磷酸酶2C(PP2C)是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶,植物PP2C廣泛參與逆境信號(hào)傳遞過(guò)程,對(duì)環(huán)境脅迫如冷害、干旱、損傷等激活的信號(hào)通路發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。
　　本研究從小麥基因組中克隆到了一個(gè)PP2

2、C類蛋白磷酸酶基因TaPP2C59,并對(duì)該基因在小麥中的表達(dá)特性與功能進(jìn)行了初步分析,主要研究結(jié)果如下:
　　(1)以生物信息學(xué)為基礎(chǔ),在數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索并拼接小麥PP2C基因的EST序列,并以此序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)特異引物,過(guò)5'-RACE和3'-RACE分別克隆到5’和3’片段,經(jīng)拼接后以特異性引物擴(kuò)增得到了TaPP2C59基因的cDNA全長(zhǎng)。
　　(2)對(duì)該基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)該基因擁有完整的開(kāi)放閱讀框,全長(zhǎng)為855

3、 bp;保守序列分析顯示,該基因?qū)儆赑P2Cc類超家族;多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),該基因推導(dǎo)的氨基酸序列含有蛋白磷酸酶2C所具有的11個(gè)保守結(jié)構(gòu)亞區(qū);進(jìn)化樹(shù)分析表明,該基因與水稻OsPP2C1基因和玉米ZmPP2C1基因的同源性最高,與模式生物擬南芥中AtPP2C59基因有較高的同源性,故將其命名為T(mén)aPP2C59。
　　(3)通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)TaPP2C59基因在不同小麥組織中的表達(dá)模式,結(jié)果顯示該基因在小麥根、莖、葉、雄蕊

4、、雌蕊、以及外稃中均有表達(dá),而且在葉片中表達(dá)量最高。
　　(4)通過(guò)非生物性逆境脅迫如低溫、PEG、高鹽處理小麥幼苗,發(fā)現(xiàn)在冷處理和NaCl處理下TaPP2C59基因的表達(dá)量呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)的模式,可以初步推斷小麥TaPP2C59基因受到低溫與高鹽逆境脅迫的抑制。
　　(5)以ABA、乙烯、雙氧水三種信號(hào)分子處理小麥幼苗,結(jié)果發(fā)現(xiàn)ABA處理下小麥TaPP2C59基因表達(dá)量降低,而雙氧水處理下TaPP2C59基因表達(dá)量上升,該結(jié)論

5、初步顯示,小麥TaPP2C59基因受ABA信號(hào)的抑制,而受到雙氧水信號(hào)的誘導(dǎo),進(jìn)而在兩條信號(hào)途徑中發(fā)揮作用。
　　(6)構(gòu)建了TaPP2C59基因過(guò)表達(dá)載體pBIl21- TaPP2C59OX,并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌,再利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化煙草葉片,通過(guò)組織培養(yǎng)獲得再生植株,利用PCR初步鑒定獲得了煙草轉(zhuǎn)基因植株。
　　本研究對(duì)小麥TaPP2C59可能參與的信號(hào)通路得出了初步的結(jié)論,所獲得的轉(zhuǎn)基因煙草材料為進(jìn)一步研究TaPP2C