不同療程治療劑量抗癲癇藥對(duì)未成熟腦發(fā)育影響的比較性研究.pdf

1、第一部分長(zhǎng)程服用治療劑量抗旅癰藥對(duì)幼鼠認(rèn)知功能的影晌 目的：排除影響癲癇患者認(rèn)知功能的其他因素，單純觀測(cè)長(zhǎng)程給予治療劑量AEDs對(duì)皮層認(rèn)知功能的影響。 方法：7日齡幼鼠及2月齡成年鼠，共100只健康SD大鼠行對(duì)比研究。選擇嬰幼兒時(shí)期臨床常用的四種AEDs：包括苯巴比妥(PB)，氯硝安定(CNP)，丙戊酸鈉(VPA)及托吡酯(TPM)，以達(dá)到與臨床治療穩(wěn)態(tài)血濃度相一致的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給藥劑量作為實(shí)驗(yàn)劑量。共設(shè)立10個(gè)實(shí)驗(yàn)組，分組

2、如下：幼鼠長(zhǎng)程CNP給藥組、幼鼠長(zhǎng)程PB給藥組、幼鼠長(zhǎng)程VPA給藥組、幼鼠長(zhǎng)程TPM給藥組、幼鼠長(zhǎng)程正常對(duì)照組、成年鼠長(zhǎng)程CNP給藥組、成年鼠長(zhǎng)程PB給藥組、成年鼠長(zhǎng)程VPA給藥組、成年鼠長(zhǎng)程TPM給藥組、成年鼠長(zhǎng)程正常對(duì)照組。用以上四種AEDs連續(xù)灌胃5周。用熒光偏振免疫分析方法，檢測(cè)各AEDs血藥濃度。分別于停藥后次日，2周及1個(gè)月，采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)及穿梭箱實(shí)驗(yàn)測(cè)試各組實(shí)驗(yàn)鼠皮層認(rèn)知功能。 結(jié)果：(1)達(dá)到與臨床治

3、療穩(wěn)態(tài)血濃度相一致的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給藥劑量：PB 30mg/kg/d，VPA 250 mg/kg/d，CNP 6 mg/kg/d，TPM 40 mg/kg/d；(2)幼鼠長(zhǎng)程給藥后次日的穿梭箱實(shí)驗(yàn)， CNP、PB、VPA、TPM組逃避潛伏期分別較對(duì)照延長(zhǎng)56.58％、53.41％、48.83％、27.51％，差異非常顯著(P<0.01)。但停藥后2周，VPA組與對(duì)照已無顯著性差異，而CNP、PB及TPM組幼鼠逃避潛伏期仍然明顯長(zhǎng)于對(duì)照組(P<

4、0.01)。繼續(xù)觀察至停藥后1月，CNP及PB組與對(duì)照組的差異仍然非常顯著(P<0.01)，逃避潛伏期分別較對(duì)照延長(zhǎng)27.3％及22.23％。成年鼠長(zhǎng)程給藥后次日的穿梭箱實(shí)驗(yàn)，除PB組，CNP、VPA、TPM組逃避潛伏期分別較對(duì)照延長(zhǎng)52.48％、27.10％、30.09％，有非常顯著差異(P<0.01)，但停藥后2周，成年鼠各AEDs組與對(duì)照組均無差別；(3)長(zhǎng)程給藥后次日Morris水迷宮測(cè)試，CNP、PB及VPA組幼鼠登平臺(tái)潛伏期

5、皆較對(duì)照顯著延長(zhǎng)(P<0.01)，分別是對(duì)照組的3.04倍、3.00倍、3.48倍。成年鼠各AEDs組的潛伏期雖亦長(zhǎng)于對(duì)照組(P<0.01)，但停藥后2周，成年鼠各AEDs組與VPA、TPM組幼鼠，其潛伏期與對(duì)照組已無顯著差別，唯有長(zhǎng)程給予CNP和PB的幼鼠潛伏期仍明顯長(zhǎng)于對(duì)照組(P<0.01)。即使停藥后1個(gè)月該兩組幼鼠潛伏期仍然較對(duì)照組明顯延長(zhǎng)(P<0.01)，分別是對(duì)照組的2.27倍及1.62倍。 結(jié)論： (1)成

6、功制備了幼鼠及成年鼠長(zhǎng)程口服AEDs，使其穩(wěn)態(tài)血濃度達(dá)到AEDs臨床治療穩(wěn)態(tài)血濃度的動(dòng)物模型； (2)通過Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)證實(shí)，長(zhǎng)程給予治療劑量的CNP或PB，可顯著和長(zhǎng)期地影響幼鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力。同樣長(zhǎng)療程治療劑量CNP、PB、VPA或TPM對(duì)成年鼠，以及TPM，VPA對(duì)幼鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力均只有短暫而可逆不良影響； (3)通過穿梭箱測(cè)試證實(shí)，長(zhǎng)程服用治療劑量PB、CNP、TPM或VPA均可不同程度地引起幼年

7、鼠的條件性學(xué)習(xí)記憶障礙。其中，TPM，VPA的負(fù)面影響短暫而可恢復(fù)，而CNP或PB的不良影響可持續(xù)到停藥后1個(gè)月或更長(zhǎng)。然而，長(zhǎng)程服用治療劑量CNP，TPM或VPA只引起成年鼠短暫條件性學(xué)習(xí)記憶障礙，PBX寸其無明顯影響。 第二部分不同療程治療劑量抗癲癇藥對(duì)未成熟腦組織學(xué)影響的實(shí)驗(yàn)研究 目的：比較性觀察給予健康大鼠不同療程治療劑量的CNP、PB、VPA或TPM，對(duì)不同成熟期大腦的組織病理學(xué)影響。 方法：健康SD大

8、鼠160只，包括7日齡幼鼠與2月齡成年鼠兩個(gè)年齡組。兩年齡組均各自隨機(jī)分為以下5個(gè)小組：正常對(duì)照、以及PB、CNP、VPA和TPM給藥組。每個(gè)小組又根據(jù)連續(xù)給藥時(shí)間分成2個(gè)亞組：即短程給藥組(2周)和長(zhǎng)程給藥組(5周)。用熒光偏振免疫分析方法，檢測(cè)各AEDs血藥濃度。停藥當(dāng)天記錄各實(shí)驗(yàn)鼠體重，腦重。對(duì)額葉皮層及海馬切片行HE染色及尼氏染色，透射電鏡觀察額葉皮層及海馬腦組織超微結(jié)構(gòu)。于停藥后1個(gè)月，再次觀察長(zhǎng)程給予CNP或PB幼鼠腦組織超

9、微結(jié)構(gòu)。 結(jié)果：(1)連續(xù)2周短療程給藥后，無論幼鼠及成年鼠，其體重、腦重以及腦重/體重比值均與正常對(duì)照組無差異。連續(xù)5周長(zhǎng)療程給藥后，成年鼠除TPM組體重低于對(duì)照(P<0.05)和其它AEDs組外(P<0.01)，其余各組成年鼠的腦重，體重均與正常對(duì)照組無顯著性差異。幼鼠CNP組體重較對(duì)照組減低(P<0.05)，且CNP及PB組幼鼠腦重較VPA組為低(P<0.05)，較正常對(duì)照組顯著為輕(P<0.01)，分別較對(duì)照減少4.73

10、％和5.36％。長(zhǎng)程給予PB組幼鼠腦重/體重比值較對(duì)照顯著減低(P<0.01)，較對(duì)照減少6.67％。其余各組腦重/體重比值較對(duì)照無差異：(2)H-E染色發(fā)現(xiàn)幼鼠不同療程VPA、TPM給藥組及成年鼠不同療程給藥組大腦額葉皮層及海馬鏡下表現(xiàn)與其相應(yīng)正常對(duì)照組無顯著差別。但幼鼠長(zhǎng)程CNP或PB給藥組可見神經(jīng)細(xì)胞明顯變形及壞死改變：(3)尼氏染色發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)程PB及CNP給藥幼鼠額葉皮層結(jié)構(gòu)模糊，神經(jīng)元排列疏松，尼氏體溶解消失現(xiàn)象，神經(jīng)細(xì)胞數(shù)分別較

11、正常對(duì)照組減少29.6％及33.5％。其余各組尼氏染色未見明顯異常；(4)透射電鏡發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)程CNP給藥幼鼠大腦神經(jīng)細(xì)胞染色質(zhì)邊集、濃縮成塊狀，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)稍擴(kuò)張，線粒體稍腫脹。停藥后1個(gè)月的電鏡觀察顯示基本正常。長(zhǎng)程PB給藥幼鼠腦神經(jīng)細(xì)胞染色質(zhì)邊集、濃縮成塊狀，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，線粒體嵴模糊不清，線粒體腫脹明顯。停藥后1個(gè)月仍見神經(jīng)細(xì)胞腫脹，神經(jīng)細(xì)胞核質(zhì)碎裂溶解等。 結(jié)論：(1)無論在幼鼠或成年鼠，短程給予PB、CNP、VPA或TPM均未引起

12、明顯腦組織結(jié)構(gòu)異常。5周的長(zhǎng)程給藥后，它們對(duì)成年鼠腦組織仍無明顯影響，唯有PB和CNP致幼鼠腦重顯著減輕，神經(jīng)元變性，死亡及數(shù)量明顯減少。電鏡下超微結(jié)構(gòu)顯著異常。表明該兩藥對(duì)幼鼠認(rèn)知功能的持續(xù)影響是基于它們對(duì)發(fā)育中腦的明顯組織損傷。 (2)長(zhǎng)程給予PB后，即使停藥后一月電鏡隨訪，幼鼠大腦神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)仍然明顯異常，提示PB對(duì)未成熟腦的組織學(xué)損傷存在不易恢復(fù)的特性。 (3)CNP引起的未成熟腦慢性損傷，與PB存在兩點(diǎn)顯著差異：一是在停藥1

13、個(gè)月后腦超微結(jié)構(gòu)已基本回復(fù)正常，顯示其腦損傷的可逆性；另一是長(zhǎng)程給藥后，PB幼鼠僅有腦重顯著降低，而CNP引起腦重與體重同時(shí)減少，提示CNP對(duì)未成熟腦的慢性損傷，可能是該藥引起全身組織細(xì)胞損傷或新陳代謝異常的一個(gè)部分。 第三部分治療劑量抗癲癇藥對(duì)腦發(fā)育不良影響機(jī)理的初步探討 目的：初步探討治療劑量抗癲癇藥影響未成熟腦發(fā)育的機(jī)理。 方法：健康SD大鼠160只，包括7日齡幼鼠與2月齡成年鼠兩個(gè)年齡組。兩年齡組均各自隨

14、機(jī)分為以下5個(gè)小組：正常對(duì)照、以及PB、CNP、VPA和TPM給藥組。每個(gè)小組又根據(jù)連續(xù)給藥時(shí)間分成2個(gè)亞組：即短程給藥組(2周)和長(zhǎng)程給藥組(5周)。用熒光偏振免疫分析方法，檢測(cè)各AEDs血藥濃度。停藥當(dāng)天取血及腦組織，ELISA方法測(cè)定血清NSE含量，免疫組化檢測(cè)額葉皮層及海馬切片凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)，原位末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)凋亡神經(jīng)細(xì)胞。 結(jié)果：(1)給予短程治療劑量的PB，可引起幼鼠血清NSE濃

15、度高出正常對(duì)照41.10％，二者有非常顯著差異(P<0.01)。長(zhǎng)程給藥，不僅PB組，而且CNP組幼鼠NSE濃度較對(duì)照亦有顯著增高(P<0.01)，分別高出正常對(duì)照34.18％及35.49％。但無論療程長(zhǎng)短，成年鼠各藥物干預(yù)組及VPA、TPM組幼鼠血清NSE濃度較對(duì)照組無增高(P>0.05)； (2)無論療程長(zhǎng)短，治療劑量的PB、CNP、VPA和TPM均不會(huì)引起成年鼠腦片Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)的改變，長(zhǎng)程服用VPA或TPM也不會(huì)影響

16、幼鼠腦片Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)。但長(zhǎng)程服用治療劑量的PB或CNP，可引起幼鼠額葉皮層Bax蛋白的過表達(dá)，分別是正常對(duì)照的2.57及2.49倍，差異非常顯著(P<0.01)。Bax/Bcl-2比值分別是對(duì)照的2.28及2.10倍；(3)短程給予治療劑量AEDs后，無論幼鼠或成年鼠，其額葉皮層及海馬均僅見散在分布的TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞，熒光強(qiáng)度弱。各成年鼠長(zhǎng)程給藥組及幼鼠長(zhǎng)程VPA或TPM給藥組，未見TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞的顯著增多。