蛋白激酶C-a對內(nèi)髓集合管上皮細(xì)胞系mIMCD3骨架actin的影響.pdf

1、目的：
　　 研究蛋白激酶C-α（PKC-α)對內(nèi)髓集合管上皮細(xì)胞系（mIMCD3）骨架actin的影響，初步探討PKC-α在集合管對尿液物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的作用機(jī)制及意義。
　　 方法：
　　 常規(guī)體外培養(yǎng)mIMCD3細(xì)胞，提取四種不同的PKC-α基因的重組體，脂質(zhì)體介導(dǎo)其轉(zhuǎn)染入mIMCD3細(xì)胞，用PKC-α基因的表達(dá)載體抗性基因藥物G418篩選后獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞，隨機(jī)分為①空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（K組）：轉(zhuǎn)染PKC-α基因空質(zhì)粒

2、重組體的細(xì)胞②野生型轉(zhuǎn)染組（W組）：轉(zhuǎn)染PKC-α基因野生型質(zhì)粒重組體的細(xì)胞③顯性激活型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（A組）：轉(zhuǎn)染PKC-α基因顯性激活型質(zhì)粒重組體的細(xì)胞④顯性滅活型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（R組）：轉(zhuǎn)染PKC-α基因顯性滅活型質(zhì)粒重組體的細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后24h顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光表達(dá)情況，評估轉(zhuǎn)染效率；轉(zhuǎn)染后72h細(xì)胞用含有G418藥物的培養(yǎng)基培養(yǎng)，并最終獲得穩(wěn)定表達(dá)PKC-α基因的細(xì)胞。Real-time 實(shí)時熒光定量PCR檢測上述各組穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的

3、PKC-α mRNA表達(dá)水平變化，western blot檢測各組穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞中PKC-α蛋白表達(dá)及其活性，細(xì)胞免疫化學(xué)方法檢測各組穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞骨架actin的結(jié)構(gòu)變化。
　　
　　 結(jié)果
　　 ⑴ 成功獲取了穩(wěn)定表達(dá)不同PKC-α基因重組體的mIMCD3細(xì)胞系。⑵ 熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后24h細(xì)胞熒光表達(dá)情況，轉(zhuǎn)染效率平均為36±2％。⑶ Real-time 熒光定量PCR結(jié)果顯示：A組、W及R組 PKC-α mRN

4、A表達(dá)較K組明顯升高(p<0.05)，而A組、W及R組三組間比較，變化不明顯(p＞0.05)。Western blot結(jié)果顯示：A組、R組及W組PKC-α蛋白表達(dá)較K組明顯升高(p<0.05)，而W組、A組與R組三組間比較，沒有明顯差別(p＞0.05)；PKC-活性檢測顯示A組與其它三組比較活性明顯升高(p<0.05)，R組活性較其它組明顯下降(p<0.05)。⑷細(xì)胞免疫化學(xué)顯示：K組及W組主要分布在細(xì)胞頂膜周邊，兩組間沒有較大區(qū)別，而