粗山羊草高分子量麥谷蛋白新亞基基因的克隆、分子進化及其遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、小麥高分子量麥谷蛋白亞基(high molecular weight glutenin,HMW-GS)是籽粒貯藏蛋白的重要組分。HMW-GS的組成和含量直接影響和決定著小麥的加工品質(zhì)。粗山羊草(Aegilops tauschii, DD,2n=2x=14)是普通小麥六倍體的D基因組的供體,存在豐富的HMW-GS的變異類型,且大多是現(xiàn)有普通小麥中不存在的新類型,是普通小麥品質(zhì)改良的一個重要基因資源。因此從粗山羊草中分離克隆這些新的HMW-

2、GS基因,不僅為粗山羊草與普通小麥的進化關(guān)系提供更多的遺傳信息,而且能夠為普通小麥品質(zhì)改良提供基因資源并拓寬普通小麥的遺傳多樣性。本文以粗山羊草為材料,對三個新的HMW-GS基因進行了克隆、序列比較和系統(tǒng)進化分析,并對1Dx1.1t基因進行了原核表達和基因槍轉(zhuǎn)化。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)一個新的x-型HMW-GS基因的分子克隆、原核表達及其系統(tǒng)進化分析
　　通過對山羊草種子儲藏蛋SDS-PAGE電泳分析發(fā)現(xiàn)了一個新的H

3、MW-GS,其在遷移率比亞基1Ax1的稍慢,我們將其命名為1Dx1.1t。利用等位基因特異性 PCR(Allele specific PCR, AS-PCR)方法對其基因編碼區(qū)進行了分離。1Dx1.1t基因全長為2628 bp,編碼874個氨基酸,是目前山羊草中分子量最大的HMW-GS基因。原核表達結(jié)果表明1Dx1.1t基因表達蛋白與種子中相應(yīng)的谷蛋白亞基遷移率相同,這說明所克隆基因確實是1Dx1.1t亞基的編碼基因。序列比較結(jié)果表明1

4、Dx1.1t與其它Dx型亞基高度相似,但也具有其它Dx型亞基不具有的新穎特征。首先,在其它Dx型亞基的N-末端都有的一個保守的三肽序列(LQE),而在1Dx1.1t的相應(yīng)的區(qū)域是不存在的;其次,在1Dx1.1t中部重復(fù)區(qū)域有3個三肽重復(fù)的結(jié)構(gòu)域(GQQGQQ)以及一個新的三肽(GQL)。系統(tǒng)分析結(jié)果表明亞基1Dx1.1t與其它Dx型亞基優(yōu)先地聚在一起和至少有三種基因型的粗山羊草參與普通小麥的形成。
　　(2)兩個新的x-型HMW-

5、GS基因的分離、二級結(jié)構(gòu)預(yù)測及其系統(tǒng)進化分析
　　利用AS-PCR法方法克隆了兩個新的y-型HMW-GS基因,分別命名為1Dy12.5t和1Dy9.5t。1Dy12.5t基因編碼的蛋白在 SDS-PAGE上的電泳遷移率遠快于亞基1Dy12,而1Dy9.5t基因編碼的蛋白的電泳遷移率處于亞基1Dy10和1By9之間。1Dy12.5t基因全長為2650 bp,其中編碼區(qū)長度為1788 bp和上游區(qū)域長度為862 bp;1Dy9.5t基

6、因編碼區(qū)長度為1995 bp,是目前分子量最大的 Dy型亞基基因。y-型HMW-GS基因上游區(qū)域的核苷酸序列比較結(jié)果1Dy12.5t基因具有其它y-型HMW-GS基因上游區(qū)域的保守區(qū)域,顯示其是一個有轉(zhuǎn)錄活性的基因,但在其啟動子(ATG)與CCACC序列之間有一個5 bp(ACGAG)的插入,這個5 bp的插入是在已知的HMW-GS基因中所沒有發(fā)現(xiàn)的。亞基1Dy12.5t和1Dy9.5t具有典型y型亞基的結(jié)構(gòu)特征。亞基1Dy12.5t與

7、1Dy13t高度相似只有9個氨基酸殘基的差別;而1Dy9.5t與1Dy12.4t和1Dy高度相似,分別有2和4個氨基酸殘基的差別。通過比較1Dy9.5t與1Dy12.4t基因序列發(fā)現(xiàn)可能是由于在1Dy9.5t基因第806和1478位的兩個16 bp核苷酸正向重復(fù)引起224個氨基酸殘基的缺失而導(dǎo)致1Dy12.4t基因的產(chǎn)生。在1Dy12.5t基因編碼區(qū)內(nèi)分別檢測到5個SNPs,其中3個SNPs引起氨基酸殘基的改變;在1Dy9.5t基因編碼