春小麥高分子量谷蛋白12亞基基因克隆及積累調(diào)控研究.pdf

1、小麥高分子量谷蛋白是小麥胚乳中主要貯存蛋白。高分子量谷蛋白的組成、數(shù)量和積累與小麥品質(zhì)關(guān)系密切。研究以亞基類型均為2+12而加工品質(zhì)差異明顯的兩個春小麥品種東農(nóng)7742和新克旱9為材料，克隆高分子量谷蛋白(HMW-G)12亞基基因及其5上游調(diào)控序列，研究兩個品種籽粒灌漿期谷蛋白亞基積累和12亞基mRNA表達，從分子水平探討轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控對亞基積累的影響。　　SDS-PAGE凝膠電泳表明，兩個品種高分子量谷蛋白亞基均在籽粒形成過程中逐漸形

2、成，并隨籽粒灌漿進程亞基類型逐漸增多，亞基一旦形成，在以后胚乳發(fā)育過程中不再消失。東農(nóng)7742高分子量谷蛋白亞基在開花后10天開始出現(xiàn)，14天亞基全部形成，新克旱9相應為12和18天，比東農(nóng)7742亞基形成晚2-4天。籽粒形成初期高分子量谷蛋白亞基積累量少，隨籽粒灌漿谷蛋白亞基積累漸增。兩個品種均在開花后20天亞基積累速度加快，最快積累出現(xiàn)在開花后22-26天，但東農(nóng)7742亞基積累速度和積累總量明顯高于新克旱9?！　±肦T-PCR

3、方法研究小麥籽粒灌漿期高分子量谷蛋白12亞基基因mRNA表達水平結(jié)果表明，東農(nóng)7742的12亞基在開花后第六天出現(xiàn)mRNA的表達(積累)，花后14天表達(積累)量最高。新克旱9mRNA的表達出現(xiàn)在開花后第10天，18天表達量達最高。在籽粒灌漿的各個時期，東農(nóng)7742的12亞基基因mRNA表達量均明顯高于新克旱9。12亞基基因mRNA的高表達可能是東農(nóng)7742的12亞基蛋白積累量高的基礎(chǔ)。轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控可能是亞基積累的主要調(diào)控方式

4、?！　±肞CR的方法克隆春小麥東農(nóng)7742和新克旱9兩個品種高分子量谷蛋白12亞基基因的全序列，分別命名pHG12DN和pHG12XKH(已在Genbank注冊，注冊號分別為AY486484和AY486485)。序列長度為1980bp，有四處堿基差異，導致一處氨基酸的變化。東農(nóng)7742與文獻報道的“中國春”序列同源性分別為99.5％，有10處堿基差異，存在兩個氨基酸的缺失和一個氨基酸的替換。新克旱9與文獻報道的序列同源性為99.6％

5、，有7處堿基差異，但只有兩個氨基酸缺失。目前尚不能確定氨基酸缺失和替換如何影響亞基的蛋白結(jié)構(gòu)和特性，但東農(nóng)7742、新克旱9和中國春(ChineseSpring)高分子量谷蛋白12亞基基因的克隆及詳細的核苷酸和氨基酸序列分析，表明品種間存在差異，為通過原核表達和蛋白純化對兩種蛋白的特性進一步的研究提供可能和基礎(chǔ)?！　】寺〉拇盒←湒|農(nóng)7742和新克旱9高分子量谷蛋白12亞基基因全序列已在Genbank上注冊(注冊號分別為AY486484

6、和AY486485)　　設(shè)計簡并引物通過PCR擴增，克隆長為917bp和919bp的東農(nóng)7742和新克旱9高分子量谷蛋白12亞基基因的上游調(diào)控序列。該序列存在一個TATA-box序列、三個CAAT-likebox序列，兩個GCN4motif和一個E-box及兩個E-likebox，推測GCN4motif和E-box與小麥胚乳的特異性表達有關(guān)。另外，在476-499bp處存在一個24bp的cerealbox，該序列與禾谷類作物的一300

7、元件同源性很高，在677-714bp處有一個38bp的HMWenhancer，該序列為高分子量谷蛋白啟動子中一段高度保守區(qū)域。上述兩個區(qū)域可能與高分子量谷蛋白基因表達量有關(guān)?？寺〉膬蓚€12亞基基因上游調(diào)控序列為進一步通過缺失分析和定點突變研究啟動子的功能創(chuàng)造了條件?！　∈状慰寺￠L為917bp和919bp的東農(nóng)7742和新克旱9的12亞基基因的兩個上游調(diào)控序列，分別命名為pHG12DN-LP和pHG12XKH-LP(已在Genbank注