紅景天中苷(苷元)類成分的抗輻射活性及其在Caco-2模型中的轉(zhuǎn)運機制研究.pdf

1、隨著我國“神州”載人航天飛行的圓滿成功,目前載人航天已成為我國一項重大的系統(tǒng)工程,被列入國家的經(jīng)濟建設(shè)計劃中。在長期航天飛行中,空間輻射是危害宇航員健康的主要因素之一。提高航天員對空間特殊環(huán)境的適應(yīng)能力和耐受能力,有效保障航天員健康是確保航天任務(wù)圓滿完成的重要前提。
　　景天科(Crassulaceae)紅景天屬(Rhodiola L.)植物為多年生草本或亞灌木植物,已有研究證明其具有明顯的抗輻射、抗氧化和調(diào)節(jié)免疫等作用。但目前對

2、紅景天的研究僅限于對其粗提物或紅景天苷的研究,對于其它活性成分的作用以及可能的機制則尚無系統(tǒng)的研究報道。苯乙素糖苷-紅景天苷(苷元為酪醇)和苯丙素糖苷-洛塞琳、絡(luò)薩維(苷元為肉桂醇)是紅景天屬植物的兩類主要活性成分,具有獨特的藥理功能,因而成為近年來紅景天活性研究的熱點。
　　本研究針對紅景天中苷(苷元)類成分,從輻射防護的抗氧化機制和免疫保護作用兩個角度切入,通過建立體外抗氧化模型和輻射所致的淋巴細胞損傷模型,對紅景天中苷(苷元

3、)類成分進行輻射防護活性評價,篩選得到抗輻射活性成分。基于篩選評價的結(jié)果,通過Caco-2單層細胞體外滲透轉(zhuǎn)運模型對目標抗輻射活性成分的口服吸收情況進行預(yù)測,對其轉(zhuǎn)運機制及影響因素進行初步探討,評估其作為輻射防護劑的可行性,為進一步深入了解其在體內(nèi)的口服吸收情況以及生物利用度等問題提供實驗依據(jù),為下一步開發(fā)高效、低毒的輻射防護劑提供基礎(chǔ)研究資料,為潛在輻射防護劑的研發(fā)和利用奠定實驗基礎(chǔ)。
　　本研究主要圍繞以下三方面內(nèi)容展開:

4、r>　　(一)從輻射防護的抗氧化機理出發(fā),利用自由基清除原理建立并優(yōu)化六種體外抗氧化模型,系統(tǒng)地對紅景天中苷(苷元)類成分的抗氧化活性進行評價。
　　輻射生物學(xué)效應(yīng)產(chǎn)生的最根本原因,是由于射線作用于機體導(dǎo)致的生物分子電離和激發(fā)的直接作用,以及由此產(chǎn)生超氧陰離子,羥自由基等活性氧(Reactive oxygen species,ROS)導(dǎo)致的繼發(fā)作用,如核酸分子、蛋白質(zhì)分子以及生物膜的損傷等。因此,清除已經(jīng)形成的ROS或者抑制其產(chǎn)生

5、,是輻射防護的主要途徑之一。本研究建立并優(yōu)化了DPPH自由基、NBT-NADH-PMS體系、羥自由基、氮氧自由基(NO)、脂質(zhì)過氧化反應(yīng)體系和鐵離子抗氧化體系六種抗氧化模型,分別測定了蘆丁苷、紅景天苷、異槲皮苷、酪醇、洛塞琳、熊果苷、絡(luò)薩維和肉桂醇對DPPH自由基、超氧陰離子、羥自由基和NO自由基四種自由基的清除能力,以及對脂質(zhì)過氧化的抑制能力和總抗氧化能力。結(jié)果表明,紅景天中的苷(苷元)類化學(xué)成分從不同方面表現(xiàn)出抗氧化活性:紅景天苷、

6、酪醇、洛塞琳、絡(luò)薩維和肉桂醇表現(xiàn)出較強的羥自由基清除能力(IC50分別為18.97μg·mL-1,10.84μg·mL-1,61.84μg·mL-1,81.08μg·mL-1,26.00μg·mL-1)。蘆丁苷和異槲皮苷表現(xiàn)出較強的DPPH自由基和超氧陰離子清除能力,抗脂質(zhì)過氧化和總抗氧化能力;熊果苷的DPPH自由基清除能力和總抗氧化能力較強。
　　(二)從輻射防護劑的免疫保護作用出發(fā),利用細胞學(xué)和分子生物學(xué)實驗方法建立體外輻射防

7、護模型,在細胞水平上對紅景天中苷(苷元)類化合物的體外抗輻射活性進行評價。
　　免疫系統(tǒng)是輻射損傷的重要靶器官,具有高度的輻射敏感性。淋巴細胞損傷是輻射導(dǎo)致機體免疫功能抑制的重要原因,因此有效地保護淋巴細胞免受輻射損傷對降低機體輻射損傷有重要意義。本研究先通過細胞增殖檢測方法比較,細胞輻射敏感性研究,增殖與輻照的量效關(guān)系考察等方面,對建立體外輻射防護模型進行了方法學(xué)評價;又在確保受試物對細胞無毒的基礎(chǔ)上,通過給予人淋巴母細胞(AH

8、H-1)10Gy60Co-γ射線一次性照射建立輻射損傷模型,以MTS法檢測紅景天苷、蘆丁苷、異槲皮苷、酪醇、洛塞琳、熊果苷和絡(luò)薩維對受到輻射后AHH-1細胞的保護作用。研究結(jié)果顯示,與模型組比較,異槲皮苷(12.5μg.mL-1,P<0.05)、紅景天苷(12.5μg.mL-1,P<0.05)、酪醇(50μg.mL-1,P<0.05)、洛塞琳(25μg.mL-1,P<0.05)、絡(luò)薩維(12.5μg.mL-1,P<0.01)和熊果苷(1

9、2.5μg.mL-1,P<0.01)均能夠顯著提高輻射損傷AHH-1的增殖活性?；诳寡趸c免疫保護兩部分實驗結(jié)果,確定了紅景天苷、酪醇、洛塞琳和絡(luò)薩維為目標抗輻射活性成分,進行下一步的滲透轉(zhuǎn)運研究。
　　(三)建立用于藥物吸收研究Caco-2滲透轉(zhuǎn)運模型,評價目標抗輻射活性成分的口服吸收情況,初步探討其轉(zhuǎn)運機制。
　　通過觀察細胞單層形態(tài),監(jiān)測跨膜電阻(TEER)值的變化以及比較普萘洛爾和阿替洛爾兩種標記物在單層模型的轉(zhuǎn)運

10、特性等指標對Caco-2細胞單層模型的可靠性進行評價。結(jié)果顯示,TEER值在Caco-2細胞單層形成過程中穩(wěn)定上升,達到實驗?zāi)Ｐ鸵髽藴?>500Ω·cm2)。胞內(nèi)轉(zhuǎn)運標記物普萘洛爾(高滲透性藥物,表觀滲透系數(shù)(Papp)=1.01×10-5cm·s-1)和胞間轉(zhuǎn)運標記物阿替洛爾(低滲透性藥物,Papp=2.20×10-7cm·s-1)呈現(xiàn)可預(yù)見的高、低Papp值,表明建立的Caco-2細胞模型在完整性、通透性等方面均符合小腸吸收機制研

11、究的要求。結(jié)合抗氧化與體外AHH-1模型兩部分實驗結(jié)果,選定抗氧化作用和保護60Co-γ射線輻照后AHH-1細胞兩方面作用均較強的紅景天苷、酪醇、洛塞琳和絡(luò)薩維為目標抗輻射活性成分,通過體外Caco-2滲透轉(zhuǎn)運模型對這四個成分的腸毒性、吸收情況及轉(zhuǎn)運機制進行研究。本研究通過考察抗輻射活性成分對Caco-2細胞24h的細胞毒性作用,對目標成分的腸毒性進行評估,并推算其用于轉(zhuǎn)運模型的安全劑量;在建立了可靠的轉(zhuǎn)運模型和確保受試物對Caco-2

12、細胞單層無顯著毒性的前提下,應(yīng)用Caco-2單層模型對受試物進行了雙向轉(zhuǎn)運研究(腸腔側(cè)向腸壁側(cè),AP→BL;腸壁側(cè)向腸腔側(cè),BL→AP),考察了轉(zhuǎn)運時間(60min-180min)和藥物濃度(50μM-200μM)對轉(zhuǎn)運的影響。然后,采用反相高效液相色譜法(RP-HPLC)測定并計算受試物在滲透轉(zhuǎn)運模型中的Papp。AP→BL轉(zhuǎn)運數(shù)據(jù)表明,紅景天苷(Papp=0.85±0.12×10-6cm·s-1)、洛塞琳(Papp=0.61±0.1

13、0×10-6cm·s-1)和絡(luò)薩維(Papp=0.74±0.12×10-6cm·s-1)均為難吸收(PappAP→BL<1×10-6cm·s-1)藥物。紅景天苷的苷元酪醇(Papp=1.52±0.16×10-6cm·s-1)滲透性要好于紅景天苷。濃度為200μM時輻射防護活性成分的雙向轉(zhuǎn)運數(shù)據(jù)未表現(xiàn)出明顯方向性(0.61×10-6cm·s-1

14、用時間呈依賴性動態(tài)變化,提示紅景天苷、酪醇、洛塞琳和絡(luò)薩維主要轉(zhuǎn)運方式為被動轉(zhuǎn)運。此外,紅景天苷BL向AP方向轉(zhuǎn)運大于AP向BL方向,提示其轉(zhuǎn)運過程可能存在外排現(xiàn)象,這也可能是造成其吸收性較差的原因。
　　綜上所述,紅景天中的苷(苷元)類化學(xué)成分從不同方面均表現(xiàn)出一定的抗氧化活性。其中,紅景天苷、酪醇、洛塞琳、絡(luò)薩維和肉桂醇表現(xiàn)出較強的羥自由基清除能力。在淋巴細胞損傷模型中,異槲皮苷、紅景天苷、絡(luò)薩維、洛塞琳、熊果苷和酪醇均能夠顯