紅景天中苷(苷元)類成分的抗輻射活性及其在Caco-2模型中的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制研究.pdf

1、隨著我國(guó)“神州”載人航天飛行的圓滿成功,目前載人航天已成為我國(guó)一項(xiàng)重大的系統(tǒng)工程,被列入國(guó)家的經(jīng)濟(jì)建設(shè)計(jì)劃中。在長(zhǎng)期航天飛行中,空間輻射是危害宇航員健康的主要因素之一。提高航天員對(duì)空間特殊環(huán)境的適應(yīng)能力和耐受能力,有效保障航天員健康是確保航天任務(wù)圓滿完成的重要前提。
　　景天科(Crassulaceae)紅景天屬(Rhodiola L.)植物為多年生草本或亞灌木植物,已有研究證明其具有明顯的抗輻射、抗氧化和調(diào)節(jié)免疫等作用。但目前對(duì)

2、紅景天的研究?jī)H限于對(duì)其粗提物或紅景天苷的研究,對(duì)于其它活性成分的作用以及可能的機(jī)制則尚無系統(tǒng)的研究報(bào)道。苯乙素糖苷-紅景天苷(苷元為酪醇)和苯丙素糖苷-洛塞琳、絡(luò)薩維(苷元為肉桂醇)是紅景天屬植物的兩類主要活性成分,具有獨(dú)特的藥理功能,因而成為近年來紅景天活性研究的熱點(diǎn)。
　　本研究針對(duì)紅景天中苷(苷元)類成分,從輻射防護(hù)的抗氧化機(jī)制和免疫保護(hù)作用兩個(gè)角度切入,通過建立體外抗氧化模型和輻射所致的淋巴細(xì)胞損傷模型,對(duì)紅景天中苷(苷元

3、)類成分進(jìn)行輻射防護(hù)活性評(píng)價(jià),篩選得到抗輻射活性成分?；诤Y選評(píng)價(jià)的結(jié)果,通過Caco-2單層細(xì)胞體外滲透轉(zhuǎn)運(yùn)模型對(duì)目標(biāo)抗輻射活性成分的口服吸收情況進(jìn)行預(yù)測(cè),對(duì)其轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制及影響因素進(jìn)行初步探討,評(píng)估其作為輻射防護(hù)劑的可行性,為進(jìn)一步深入了解其在體內(nèi)的口服吸收情況以及生物利用度等問題提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),為下一步開發(fā)高效、低毒的輻射防護(hù)劑提供基礎(chǔ)研究資料,為潛在輻射防護(hù)劑的研發(fā)和利用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　本研究主要圍繞以下三方面內(nèi)容展開:

4、r>　　(一)從輻射防護(hù)的抗氧化機(jī)理出發(fā),利用自由基清除原理建立并優(yōu)化六種體外抗氧化模型,系統(tǒng)地對(duì)紅景天中苷(苷元)類成分的抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　輻射生物學(xué)效應(yīng)產(chǎn)生的最根本原因,是由于射線作用于機(jī)體導(dǎo)致的生物分子電離和激發(fā)的直接作用,以及由此產(chǎn)生超氧陰離子,羥自由基等活性氧(Reactive oxygen species,ROS)導(dǎo)致的繼發(fā)作用,如核酸分子、蛋白質(zhì)分子以及生物膜的損傷等。因此,清除已經(jīng)形成的ROS或者抑制其產(chǎn)生

5、,是輻射防護(hù)的主要途徑之一。本研究建立并優(yōu)化了DPPH自由基、NBT-NADH-PMS體系、羥自由基、氮氧自由基(NO)、脂質(zhì)過氧化反應(yīng)體系和鐵離子抗氧化體系六種抗氧化模型,分別測(cè)定了蘆丁苷、紅景天苷、異槲皮苷、酪醇、洛塞琳、熊果苷、絡(luò)薩維和肉桂醇對(duì)DPPH自由基、超氧陰離子、羥自由基和NO自由基四種自由基的清除能力,以及對(duì)脂質(zhì)過氧化的抑制能力和總抗氧化能力。結(jié)果表明,紅景天中的苷(苷元)類化學(xué)成分從不同方面表現(xiàn)出抗氧化活性:紅景天苷、

6、酪醇、洛塞琳、絡(luò)薩維和肉桂醇表現(xiàn)出較強(qiáng)的羥自由基清除能力(IC50分別為18.97μg·mL-1,10.84μg·mL-1,61.84μg·mL-1,81.08μg·mL-1,26.00μg·mL-1)。蘆丁苷和異槲皮苷表現(xiàn)出較強(qiáng)的DPPH自由基和超氧陰離子清除能力,抗脂質(zhì)過氧化和總抗氧化能力;熊果苷的DPPH自由基清除能力和總抗氧化能力較強(qiáng)。
　　(二)從輻射防護(hù)劑的免疫保護(hù)作用出發(fā),利用細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法建立體外輻射防

7、護(hù)模型,在細(xì)胞水平上對(duì)紅景天中苷(苷元)類化合物的體外抗輻射活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　免疫系統(tǒng)是輻射損傷的重要靶器官,具有高度的輻射敏感性。淋巴細(xì)胞損傷是輻射導(dǎo)致機(jī)體免疫功能抑制的重要原因,因此有效地保護(hù)淋巴細(xì)胞免受輻射損傷對(duì)降低機(jī)體輻射損傷有重要意義。本研究先通過細(xì)胞增殖檢測(cè)方法比較,細(xì)胞輻射敏感性研究,增殖與輻照的量效關(guān)系考察等方面,對(duì)建立體外輻射防護(hù)模型進(jìn)行了方法學(xué)評(píng)價(jià);又在確保受試物對(duì)細(xì)胞無毒的基礎(chǔ)上,通過給予人淋巴母細(xì)胞(AH

8、H-1)10Gy60Co-γ射線一次性照射建立輻射損傷模型,以MTS法檢測(cè)紅景天苷、蘆丁苷、異槲皮苷、酪醇、洛塞琳、熊果苷和絡(luò)薩維對(duì)受到輻射后AHH-1細(xì)胞的保護(hù)作用。研究結(jié)果顯示,與模型組比較,異槲皮苷(12.5μg.mL-1,P<0.05)、紅景天苷(12.5μg.mL-1,P<0.05)、酪醇(50μg.mL-1,P<0.05)、洛塞琳(25μg.mL-1,P<0.05)、絡(luò)薩維(12.5μg.mL-1,P<0.01)和熊果苷(1

9、2.5μg.mL-1,P<0.01)均能夠顯著提高輻射損傷AHH-1的增殖活性?；诳寡趸c免疫保護(hù)兩部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果,確定了紅景天苷、酪醇、洛塞琳和絡(luò)薩維為目標(biāo)抗輻射活性成分,進(jìn)行下一步的滲透轉(zhuǎn)運(yùn)研究。
　　(三)建立用于藥物吸收研究Caco-2滲透轉(zhuǎn)運(yùn)模型,評(píng)價(jià)目標(biāo)抗輻射活性成分的口服吸收情況,初步探討其轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。
　　通過觀察細(xì)胞單層形態(tài),監(jiān)測(cè)跨膜電阻(TEER)值的變化以及比較普萘洛爾和阿替洛爾兩種標(biāo)記物在單層模型的轉(zhuǎn)運(yùn)

10、特性等指標(biāo)對(duì)Caco-2細(xì)胞單層模型的可靠性進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示,TEER值在Caco-2細(xì)胞單層形成過程中穩(wěn)定上升,達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ鸵髽?biāo)準(zhǔn)(>500Ω·cm2)。胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)標(biāo)記物普萘洛爾(高滲透性藥物,表觀滲透系數(shù)(Papp)=1.01×10-5cm·s-1)和胞間轉(zhuǎn)運(yùn)標(biāo)記物阿替洛爾(低滲透性藥物,Papp=2.20×10-7cm·s-1)呈現(xiàn)可預(yù)見的高、低Papp值,表明建立的Caco-2細(xì)胞模型在完整性、通透性等方面均符合小腸吸收機(jī)制研

11、究的要求。結(jié)合抗氧化與體外AHH-1模型兩部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選定抗氧化作用和保護(hù)60Co-γ射線輻照后AHH-1細(xì)胞兩方面作用均較強(qiáng)的紅景天苷、酪醇、洛塞琳和絡(luò)薩維為目標(biāo)抗輻射活性成分,通過體外Caco-2滲透轉(zhuǎn)運(yùn)模型對(duì)這四個(gè)成分的腸毒性、吸收情況及轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制進(jìn)行研究。本研究通過考察抗輻射活性成分對(duì)Caco-2細(xì)胞24h的細(xì)胞毒性作用,對(duì)目標(biāo)成分的腸毒性進(jìn)行評(píng)估,并推算其用于轉(zhuǎn)運(yùn)模型的安全劑量;在建立了可靠的轉(zhuǎn)運(yùn)模型和確保受試物對(duì)Caco-2

12、細(xì)胞單層無顯著毒性的前提下,應(yīng)用Caco-2單層模型對(duì)受試物進(jìn)行了雙向轉(zhuǎn)運(yùn)研究(腸腔側(cè)向腸壁側(cè),AP→BL;腸壁側(cè)向腸腔側(cè),BL→AP),考察了轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間(60min-180min)和藥物濃度(50μM-200μM)對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。然后,采用反相高效液相色譜法(RP-HPLC)測(cè)定并計(jì)算受試物在滲透轉(zhuǎn)運(yùn)模型中的Papp。AP→BL轉(zhuǎn)運(yùn)數(shù)據(jù)表明,紅景天苷(Papp=0.85±0.12×10-6cm·s-1)、洛塞琳(Papp=0.61±0.1

13、0×10-6cm·s-1)和絡(luò)薩維(Papp=0.74±0.12×10-6cm·s-1)均為難吸收(PappAP→BL<1×10-6cm·s-1)藥物。紅景天苷的苷元酪醇(Papp=1.52±0.16×10-6cm·s-1)滲透性要好于紅景天苷。濃度為200μM時(shí)輻射防護(hù)活性成分的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)數(shù)據(jù)未表現(xiàn)出明顯方向性(0.61×10-6cm·s-1

14、用時(shí)間呈依賴性動(dòng)態(tài)變化,提示紅景天苷、酪醇、洛塞琳和絡(luò)薩維主要轉(zhuǎn)運(yùn)方式為被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)。此外,紅景天苷BL向AP方向轉(zhuǎn)運(yùn)大于AP向BL方向,提示其轉(zhuǎn)運(yùn)過程可能存在外排現(xiàn)象,這也可能是造成其吸收性較差的原因。
　　綜上所述,紅景天中的苷(苷元)類化學(xué)成分從不同方面均表現(xiàn)出一定的抗氧化活性。其中,紅景天苷、酪醇、洛塞琳、絡(luò)薩維和肉桂醇表現(xiàn)出較強(qiáng)的羥自由基清除能力。在淋巴細(xì)胞損傷模型中,異槲皮苷、紅景天苷、絡(luò)薩維、洛塞琳、熊果苷和酪醇均能夠顯