泛素相關(guān)蛋白1基因UBAP1與腫瘤抑制基因p16在急性白血病中的表達(dá)研究.pdf

1、目的：
　　 急性白血病的發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，但研究表明細(xì)胞周期調(diào)控失常、增殖異常、分化障礙、凋亡受阻等與其密切有關(guān)，并且許多因子如細(xì)胞周期蛋白及其相關(guān)抑制劑、轉(zhuǎn)錄因子及其相關(guān)抑制劑等參與其中，并發(fā)揮十分重要的作用。
　　 UBAP1是泛素相關(guān)蛋白家族的新成員，其結(jié)構(gòu)中的UBA結(jié)構(gòu)域能夠介導(dǎo)靶蛋白與泛素蛋白非共價(jià)結(jié)合，使靶蛋白發(fā)生泛素化，進(jìn)而被26S蛋白酶體降解。p16是細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制劑家族的一員，能夠有效阻

2、止細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，從而發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖的作用。
　　 UBAP1基因和p16基因同位于9號(hào)染色體p21-22，其中UBAP1基因在惡性腫瘤的研究中表達(dá)水平不一，在急性白血病中至今尚無(wú)報(bào)道；p16基因在眾多惡性腫瘤組織中呈低表達(dá)，屬于腫瘤抑制基因，并與急性白血病的發(fā)病密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)主要研究UBAP1基因和p16基因在急性白血病中的表達(dá)情況及二者的相關(guān)性，將為急性白血病的病因?qū)W研究及靶基因治療奠定重要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　

3、 方法：
　　 1、收集EDTA抗凝骨髓液3～5ml，來(lái)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院血液病治療中心2008年8月～2009年8月間門(mén)診及住院的患者，其中初診急性白血病患者56例作為實(shí)驗(yàn)組，非惡性血液病患者22例作為對(duì)照組。采用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液提取骨髓標(biāo)本中單個(gè)核細(xì)胞（MNC），生理鹽水洗滌兩次后，每（2～8）×106個(gè)細(xì)胞中加入1ml Trizol試劑，放入-80℃冰箱凍存。
　　 2、采用Trizol、氯仿、

4、異丙醇和75％乙醇提取標(biāo)本中總RNA，并利用DU800核酸蛋白分析儀檢測(cè)RNA純度，選取純度在1.8～2.0之間的RNA，按照TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明，利用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）技術(shù)合成cDNA，-80℃冰箱凍存。
　　 3、UBAPl和p16為目的基因，GAPDH為內(nèi)參照基因，引物由大連寶生物工程有限公司設(shè)計(jì)并合成，定量反應(yīng)試劑盒由TaKaRa公司提供，采用SYBR Green Ⅰ熒光染料實(shí)時(shí)定量PCR法進(jìn)行

5、檢測(cè)。將標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋4～5個(gè)濃度，每個(gè)濃度分別取21×1作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)定量分析軟件構(gòu)建目的基因和內(nèi)參照基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線讀取樣本拷貝數(shù)，最終將目的基因與內(nèi)參照基因拷貝數(shù)的比值作為樣本mRNA的相對(duì)量。反應(yīng)結(jié)束后將擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.5％的瓊脂糖凝膠電泳紫外燈下照相觀察。
　　 4、收集同期病例組樣本的肝素抗凝骨髓2～3ml，采用直接法和24h培養(yǎng)法制備染色體，滴片、R顯帶、Giemsa染色，Olympus BX5

6、1顯微鏡下進(jìn)行核型分析，根據(jù)《人類細(xì)胞遺傳學(xué)國(guó)際命名體制（ISCN 2005）》描述核型。
　　 5、采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，p<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。UBAP1基因和p16基因的mRNA表達(dá)水平在急性白血病各亞型及分組中比較采用Kolmogorov-Smirnov Z秩和檢驗(yàn)（統(tǒng)計(jì)量用z表示），這兩種基因表達(dá)水平在染色體預(yù)后分組之間的比較采用Kruskal-Wallis H秩和檢驗(yàn)，UBAP1基因和p16

7、基因的mRNA表達(dá)水平相關(guān)性檢驗(yàn)采用Spearman相關(guān)性分析。
　　 結(jié)果：
　　 1、共收集初診AL 58例，非惡性血液病25例，提取單個(gè)核細(xì)胞、總RNA后經(jīng)DU800核酸蛋白分析儀檢測(cè)，將純度在1.8～2.0之間的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，最終獲得cDNA標(biāo)本78例，其中病例組56例，對(duì)照組22例。
　　 2、成功建立標(biāo)準(zhǔn)曲線（R2=0.9996，斜率為-3.29），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線讀取目的基因和內(nèi)參照基因的拷貝數(shù)，通

8、過(guò)目的基因的拷貝數(shù)/內(nèi)參照基因的拷貝數(shù)得到mRNA的相對(duì)量；目的基因熔解曲線呈單峰，說(shuō)明擴(kuò)增產(chǎn)物均一，無(wú)非特異性擴(kuò)增及引物二聚體；1.5％瓊脂糖凝膠電泳紫外燈下觀察，進(jìn)一步驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)相符。
　　 3、共收集并制備染色體標(biāo)本41例，其中38例可進(jìn)行核型分析，并根據(jù)SWOG標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行預(yù)后分組。
　　 4、統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果：在急性白血病中，UBAP1基因的mRNA較對(duì)照組呈高表達(dá)，p16基因的mRNA呈低表達(dá)（p

9、<0.01）。將所有病例進(jìn)行FAB分型分組比較，p16基因除成人FAB分型的M1、M2和M3外，其余組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；UBAP1基因，僅在成人FAB分型的M4和M5中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。UBAP1基因和p16基因的mRNA表達(dá)水平在SWOG染色體預(yù)后分組中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）。UBAP1基因和P16基因表達(dá)水平在對(duì)照組中呈顯著的負(fù)相關(guān)（r=-0.827，p<0.01），而在病例組中則無(wú)相關(guān)性