泛素相關(guān)蛋白1基因UBAP1與腫瘤抑制基因p16在急性白血病中的表達研究.pdf

1、目的：
　　 急性白血病的發(fā)病機制目前尚不明確，但研究表明細胞周期調(diào)控失常、增殖異常、分化障礙、凋亡受阻等與其密切有關(guān)，并且許多因子如細胞周期蛋白及其相關(guān)抑制劑、轉(zhuǎn)錄因子及其相關(guān)抑制劑等參與其中，并發(fā)揮十分重要的作用。
　　 UBAP1是泛素相關(guān)蛋白家族的新成員，其結(jié)構(gòu)中的UBA結(jié)構(gòu)域能夠介導(dǎo)靶蛋白與泛素蛋白非共價結(jié)合，使靶蛋白發(fā)生泛素化，進而被26S蛋白酶體降解。p16是細胞周期蛋白依賴激酶抑制劑家族的一員，能夠有效阻

2、止細胞由G1期進入S期，從而發(fā)揮抑制細胞增殖的作用。
　　 UBAP1基因和p16基因同位于9號染色體p21-22，其中UBAP1基因在惡性腫瘤的研究中表達水平不一，在急性白血病中至今尚無報道；p16基因在眾多惡性腫瘤組織中呈低表達，屬于腫瘤抑制基因，并與急性白血病的發(fā)病密切相關(guān)。本實驗主要研究UBAP1基因和p16基因在急性白血病中的表達情況及二者的相關(guān)性，將為急性白血病的病因?qū)W研究及靶基因治療奠定重要的實驗基礎(chǔ)。
　　

3、 方法：
　　 1、收集EDTA抗凝骨髓液3～5ml，來自中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院血液病治療中心2008年8月～2009年8月間門診及住院的患者，其中初診急性白血病患者56例作為實驗組，非惡性血液病患者22例作為對照組。采用Ficoll淋巴細胞分離液提取骨髓標本中單個核細胞（MNC），生理鹽水洗滌兩次后，每（2～8）×106個細胞中加入1ml Trizol試劑，放入-80℃冰箱凍存。
　　 2、采用Trizol、氯仿、

4、異丙醇和75％乙醇提取標本中總RNA，并利用DU800核酸蛋白分析儀檢測RNA純度，選取純度在1.8～2.0之間的RNA，按照TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，利用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）技術(shù)合成cDNA，-80℃冰箱凍存。
　　 3、UBAPl和p16為目的基因，GAPDH為內(nèi)參照基因，引物由大連寶生物工程有限公司設(shè)計并合成，定量反應(yīng)試劑盒由TaKaRa公司提供，采用SYBR Green Ⅰ熒光染料實時定量PCR法進行

5、檢測。將標準品梯度稀釋4～5個濃度，每個濃度分別取21×1作為模板進行擴增，通過定量分析軟件構(gòu)建目的基因和內(nèi)參照基因的標準曲線，根據(jù)標準曲線讀取樣本拷貝數(shù)，最終將目的基因與內(nèi)參照基因拷貝數(shù)的比值作為樣本mRNA的相對量。反應(yīng)結(jié)束后將擴增產(chǎn)物采用1.5％的瓊脂糖凝膠電泳紫外燈下照相觀察。
　　 4、收集同期病例組樣本的肝素抗凝骨髓2～3ml，采用直接法和24h培養(yǎng)法制備染色體，滴片、R顯帶、Giemsa染色，Olympus BX5

6、1顯微鏡下進行核型分析，根據(jù)《人類細胞遺傳學(xué)國際命名體制（ISCN 2005）》描述核型。
　　 5、采用SPSS16.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，p<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。UBAP1基因和p16基因的mRNA表達水平在急性白血病各亞型及分組中比較采用Kolmogorov-Smirnov Z秩和檢驗（統(tǒng)計量用z表示），這兩種基因表達水平在染色體預(yù)后分組之間的比較采用Kruskal-Wallis H秩和檢驗，UBAP1基因和p16

7、基因的mRNA表達水平相關(guān)性檢驗采用Spearman相關(guān)性分析。
　　 結(jié)果：
　　 1、共收集初診AL 58例，非惡性血液病25例，提取單個核細胞、總RNA后經(jīng)DU800核酸蛋白分析儀檢測，將純度在1.8～2.0之間的RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，最終獲得cDNA標本78例，其中病例組56例，對照組22例。
　　 2、成功建立標準曲線（R2=0.9996，斜率為-3.29），根據(jù)標準曲線讀取目的基因和內(nèi)參照基因的拷貝數(shù)，通

8、過目的基因的拷貝數(shù)/內(nèi)參照基因的拷貝數(shù)得到mRNA的相對量；目的基因熔解曲線呈單峰，說明擴增產(chǎn)物均一，無非特異性擴增及引物二聚體；1.5％瓊脂糖凝膠電泳紫外燈下觀察，進一步驗證擴增產(chǎn)物片段長度與實驗設(shè)計相符。
　　 3、共收集并制備染色體標本41例，其中38例可進行核型分析，并根據(jù)SWOG標準進行預(yù)后分組。
　　 4、統(tǒng)計分析結(jié)果：在急性白血病中，UBAP1基因的mRNA較對照組呈高表達，p16基因的mRNA呈低表達（p

9、<0.01）。將所有病例進行FAB分型分組比較，p16基因除成人FAB分型的M1、M2和M3外，其余組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）；UBAP1基因，僅在成人FAB分型的M4和M5中差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）。UBAP1基因和p16基因的mRNA表達水平在SWOG染色體預(yù)后分組中差異無統(tǒng)計學(xué)意義（p>0.05）。UBAP1基因和P16基因表達水平在對照組中呈顯著的負相關(guān)（r=-0.827，p<0.01），而在病例組中則無相關(guān)性