HSV-gB、gD蛋白重組串聯(lián)抗原表位蛋白的表達(dá)及鑒定.pdf

1、單純皰疹病毒(Herpes Simplex Virus,HSV)性角膜炎是一種嚴(yán)重的世界性致盲性眼病,HSV感染眼部后,病毒會在三叉神經(jīng)節(jié)建立一種長久的潛伏狀態(tài),從而造成患者的反復(fù)感染[1],因此,研制預(yù)防HSV感染、潛伏和復(fù)發(fā)的疫苗具有重要意義。本研究利用生物信息學(xué)軟件分析gB和gD蛋白抗原表位,設(shè)計(jì)兩者抗原表位串聯(lián)基因,利用大腸桿菌質(zhì)粒構(gòu)建該基因的表達(dá)載體,在大腸桿菌中表達(dá)了該蛋白并進(jìn)行了鑒定。
　　 材料和方法
　　

2、 1、材料
　　 (1)質(zhì)粒及菌種 表達(dá)載體PET-28a,大腸桿菌JM109,表達(dá)菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。
　　 (2)分子生物學(xué)試劑Polymerase Taq DNA聚合酶、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、卡那霉素,DNA標(biāo)志物DL2000,質(zhì)粒抽提試劑盒、DNA膠回收試劑盒,XhoI、EcoRI內(nèi)切酶,T4 DNA連接酶,預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn),及其余進(jìn)口或國產(chǎn)分析純以上級試劑。PCR引物由上海

3、生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成。
　　 2、方法
　　 (1)gB、gD糖蛋白抗原表位串聯(lián)基因的設(shè)計(jì)與合成
　　 應(yīng)用生物信息學(xué)分析軟件laser gene DNASTAR分析gB、gD蛋白抗原表位,設(shè)計(jì)表串聯(lián)序列,根據(jù)遺傳密碼設(shè)計(jì)表位串聯(lián)基因,并附加His標(biāo)簽,命名為X基因,由上海生工公司合成并測序。
　　 (2)X基因表達(dá)載體的構(gòu)建
　　 以X基因DNA為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增并回收純化PCR產(chǎn)物

4、。將用限制性內(nèi)切酶XhoI及EcoRI處理后的X基因片段的PCR.產(chǎn)物和PET28(a)載體連接獲得表達(dá)載體PET-X,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),篩選陽性克隆并鑒定。
　　 (3)X基因的表達(dá)
　　 將含有PET-X重組質(zhì)粒的陽性克隆BL21(DE3)大腸桿菌進(jìn)行培養(yǎng)并留取陰性對照,加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)[4],分別收集誘導(dǎo)表達(dá)后1h、2h、3h的菌液,將各組樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測。
　　 (4)重

5、組蛋白的Western Blotting鑒定
　　 分別以Penta-His Antibody和HRP-Rabbit Anti-Mouse IgG抗體為第一、第二抗體進(jìn)行重組蛋白的Western Blotting鑒定。
　　 3、結(jié)果
　　 (1)gB、gD糖蛋白抗原表位串聯(lián)基因的設(shè)計(jì)與合成
　　 應(yīng)用laser gene DNASTAR軟件分析選取了gB、gD糖蛋白的9個抗原表位,設(shè)計(jì)重組表位串聯(lián)基因,

6、長1299bp,編碼433氨基酸殘基,命名為X基因。
　　 (2)X基因的PCR擴(kuò)增
　　 取PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測,結(jié)果顯示,擴(kuò)增出一條特異的、大小約為1300bp的DNA片段,與預(yù)期的大小(1299bp)基本一致,初步證實(shí)PCR產(chǎn)物為目的基因片段,獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)序列測定為正確的X基因。
　　 (3)X基因表達(dá)質(zhì)粒PET-X的構(gòu)建與鑒定
　　 將重組的PET-X質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶XhoI

7、和EcoRI酶切,初步鑒定構(gòu)建成功。構(gòu)建的PET-X質(zhì)粒進(jìn)行堿基序列測序,證明插入的序列符合設(shè)計(jì)方案,測序由大連寶生物公司完成。
　　 (4)重組蛋白X的表達(dá)
　　 將陰性對照組和分別經(jīng)IPTG誘導(dǎo)1h、2h、3h后的重組菌裂解液進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測,可見相對分子質(zhì)量(Mr)約47kD處的蛋白條帶,與預(yù)期的47.5kD目的蛋白相符,未經(jīng)誘導(dǎo)的對照組該蛋白條帶較細(xì),而誘導(dǎo)1h、2h、3h組該處蛋白條帶明顯增粗,可初

8、步證明重組表達(dá)載體有X蛋白的表達(dá),該條帶即為重組菌的表達(dá)帶。
　　 (5)重組蛋白X的Western Blotting鑒定
　　 將IPTG誘導(dǎo)表達(dá)前后的菌體裂解液經(jīng)Western Blotting鑒定,結(jié)果表明,在誘導(dǎo)后1h、2h、3h組均出現(xiàn)了His標(biāo)簽陽性的識別條帶,大小約47kD,而陰性對照組則未見條帶,表明經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后重組表達(dá)體PET-X表達(dá)出了含His標(biāo)簽的約47.5kD大小的目的蛋白,且不同表達(dá)時間所表