miR-26b在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外軟骨分化中的表達(dá)與功能.pdf

1、背景腫瘤、創(chuàng)傷、炎癥、代謝異常等造成的軟骨損傷和退變是骨科臨床上常見(jiàn)且尚不能有效解決的難題之一。組織工程技術(shù)的發(fā)展為軟骨缺損的修復(fù)帶來(lái)了希望，成為研究熱點(diǎn)，作為種子細(xì)胞的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）具有多向分化潛能和自身強(qiáng)大增殖更新能力更被廣泛研究。但軟骨分化的誘導(dǎo)方法有待進(jìn)一步的研究改進(jìn)，分化調(diào)控及損傷修復(fù)的機(jī)制仍不是很清楚。microRNAs（miRNAs）是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)長(zhǎng)度約22個(gè)核苷酸的非編碼RNAs分子。研究表明，它在

2、干細(xì)胞的增殖、分化發(fā)育過(guò)程通過(guò)轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控發(fā)揮著重要作用，也有可能參與BMSCs體內(nèi)外分化為軟骨細(xì)胞的調(diào)控以及軟骨發(fā)育、成熟及生物學(xué)特性的維持。本實(shí)驗(yàn)室前期研究中通過(guò)miRNAs基因芯片已獲取BMSCs及其誘導(dǎo)分化的軟骨細(xì)胞的差異性miRNAs表達(dá)譜。
　　目的:本課題在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）及其誘導(dǎo)分化的軟骨細(xì)胞中miRNA基因的差異表達(dá)譜的基礎(chǔ)上進(jìn)一步篩選和驗(yàn)證出軟骨分化相關(guān)調(diào)控作用的miRNAs并研究其生物學(xué)功能

3、，為進(jìn)一步闡明miRNA在BMSCs軟骨分化過(guò)程中的作用和意義提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法:（1）利用全骨髓貼壁培養(yǎng)法自人骨髓中分離BMSCs，在體外擴(kuò)增傳代培養(yǎng)，通過(guò)對(duì)其形態(tài)特點(diǎn)的觀察、細(xì)胞表面標(biāo)志物檢測(cè)及多向誘導(dǎo)分化，對(duì)培養(yǎng)的人BMSCs進(jìn)行鑒定。（2）采用體外單層培養(yǎng)方法，經(jīng)含有TGF-β1、胰島素、地塞米松、轉(zhuǎn)鐵蛋白、維生素C和牛血清白蛋白的軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液誘導(dǎo)21天，通過(guò)HE染色、甲苯胺藍(lán)染色、Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色對(duì)誘導(dǎo)分

4、化的軟骨細(xì)胞進(jìn)行鑒定。（3）在人BMSCs及其誘導(dǎo)分化的軟骨細(xì)胞miRNAs的差異表達(dá)譜的基礎(chǔ)上，采用生物信息學(xué)分析及實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)一步篩選和驗(yàn)證差異表達(dá)的miRNA基因。（4）轉(zhuǎn)染miR-26b的模擬物及阻遏物至人BMSCs中，培養(yǎng)21天后，通過(guò)HE染色、甲苯胺藍(lán)、免疫組織化學(xué)染色對(duì)轉(zhuǎn)染后的實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組進(jìn)行鑒定。
　　結(jié)果:（1）經(jīng)骨髓分離培養(yǎng)所得到的細(xì)胞符合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞特征，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物CD29、CD4

5、4為陽(yáng)性，CD34、CD45為陰性，細(xì)胞周期僅有13.1％細(xì)胞處于活躍增殖期，體外經(jīng)誘導(dǎo)可分化為成骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞。（2）人BMSCs經(jīng)含TGF-β1、胰島素、地塞米松、轉(zhuǎn)鐵蛋白、維生素C和牛血清白蛋白的G-DMEM培養(yǎng)基誘導(dǎo)21天后，HE染色、甲苯胺藍(lán)、免疫組織化學(xué)染色均陽(yáng)性，符合軟骨細(xì)胞的特征。（3）篩選并驗(yàn)證了4個(gè)與軟骨分化相關(guān)的miRNAs，miR-26b,miR-28,miR-130b,miR-152,這些miRNAs在軟骨分

6、化過(guò)程中表達(dá)增高。（4）轉(zhuǎn)染miRNA-26b模擬物能促進(jìn)人BMSCs向軟骨細(xì)胞分化，轉(zhuǎn)染miRNA-26b阻礙物后繼續(xù)加入軟骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)時(shí)BMSCs仍可向軟骨細(xì)胞分化。
　　結(jié)論:綜上所述，我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了：（1）用全骨髓貼壁生長(zhǎng)法可以從骨髓中分離得到人BMSCs，并可在體外將其誘導(dǎo)分化為軟骨細(xì)胞。（2）在人BMSCs及其軟骨誘導(dǎo)分化過(guò)程中存在表達(dá)差異的miRNAs，這些差異性的miRNAs可能對(duì)人BMSCs的軟骨誘導(dǎo)分化起著