抗華支睪吸蟲(chóng)成蟲(chóng)抗原McAb的制備及其功能的研究.pdf

1、目的：利用雜交瘤細(xì)胞技術(shù)制備抗華支睪吸蟲(chóng)成蟲(chóng)抗原單克隆抗體并對(duì)其進(jìn)行功能鑒定，以期能獲得敏感性高、特異性強(qiáng)的檢測(cè)肝吸蟲(chóng)循環(huán)抗原的工具，為華支睪吸蟲(chóng)病的診斷標(biāo)準(zhǔn)化和流行病學(xué)調(diào)查奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：從感染華支睪吸蟲(chóng)的麥穗魚(yú)中分離囊蚴并感染豚鼠，獲取華支睪吸蟲(chóng)成蟲(chóng)并制備成蟲(chóng)抗原。以成蟲(chóng)抗原免疫小鼠，經(jīng)過(guò)三輪基礎(chǔ)免疫和一次加強(qiáng)免疫后，使免疫小鼠脾細(xì)胞具有穩(wěn)定分泌抗華支睪吸蟲(chóng)抗體的能力。在融合劑PEG的作用下將免疫小鼠脾細(xì)胞與Sp2/

2、0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，獲得雜交瘤細(xì)胞。在HAT和HT選擇培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件下，以間接ELISA法對(duì)獲得的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆化篩選。對(duì)穩(wěn)定分泌抗華支睪吸蟲(chóng)McAb株采用動(dòng)物體內(nèi)誘生的方法進(jìn)行制備。以飽和硫酸銨沉淀法和FPLC法對(duì)獲得的單抗腹水進(jìn)行純化和純度鑒定。以間接ELISA法對(duì)單抗腹水進(jìn)行效價(jià)測(cè)定、亞類測(cè)定及特異性檢測(cè)，Dot-blot法檢測(cè)單抗免疫學(xué)活性。用IFAT進(jìn)行單抗對(duì)蟲(chóng)體的識(shí)別部位觀察，用免疫組化觀察單抗與感染小鼠肝臟組織中抗

3、原的結(jié)合。
　　 結(jié)果：經(jīng)過(guò)動(dòng)物免疫、細(xì)胞融合、選擇性培養(yǎng)，克隆化篩選后獲得1株穩(wěn)定分泌抗華支睪吸蟲(chóng)成蟲(chóng)抗原的單克隆抗體株，命名為D10，該細(xì)胞生長(zhǎng)良好，穩(wěn)定性好，經(jīng)過(guò)連續(xù)傳代20次，-70℃冰箱保存后復(fù)蘇仍然具有良好生長(zhǎng)狀態(tài)及穩(wěn)定分泌抗體的能力；用此株單抗制備小鼠腹水液，純化后腹水蛋白濃度為2.2mg/ml，抗體效價(jià)檢測(cè)達(dá)到1：200000以上，單抗亞類鑒定顯示為IgG1類，F(xiàn)PLC法觀察見(jiàn)純化單抗D10的洗脫峰只有一個(gè)單一峰

4、，而且對(duì)稱性好，純度達(dá)到90％以上。SDS-PAGE電泳顯示單抗的重鏈分子量為50KDa，輕鏈分子量為26KDa。ELISA法檢測(cè)其與豬囊尾蚴、弓形蟲(chóng)、瘧原蟲(chóng)和日本血吸蟲(chóng)抗原無(wú)交叉反應(yīng)。
　　 免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察到單抗D10能與華支睪吸蟲(chóng)蟲(chóng)體的表皮及蟲(chóng)卵結(jié)合。免疫組化顯示單抗D10可與病變肝臟組織中匯管區(qū)及周圍間質(zhì)中的抗原結(jié)合。
　　 結(jié)論：(1)獲得穩(wěn)定分泌抗華支睪吸蟲(chóng)成蟲(chóng)抗原單克隆抗體株1株，命名為D10。(2)單克隆