Nrf2-ARE通路在腎間質(zhì)纖維化中的表達及丁苯肽的腎保護作用.pdf

1、目的:腎間質(zhì)纖維化(renal interstitial fibrosis RIF)是指由多種原因引起的細胞外基質(zhì)成分(ECM)在腎間質(zhì)內(nèi)過度沉積，是各種慢性腎臟疾病進行性發(fā)展的共同病理基礎(chǔ)。目前其發(fā)病機制尚未完全闡明?，F(xiàn)有研究證明，氧化應(yīng)激損傷在腎間質(zhì)纖維化發(fā)病過程中起重要作用，抗氧化能有效延緩腎間質(zhì)纖維化進程。近些年人們研究發(fā)現(xiàn)Keap1-Nrf2-ARE信號通路介導(dǎo)并激活多種抗氧化基因和Ⅱ相解毒酶基因的轉(zhuǎn)錄，從而減輕ROS和親電子

2、物質(zhì)引起的細胞損傷，這一信號通路在機體抗氧化應(yīng)激、抗腫瘤、抗衰老、保護缺血再灌注組織等方面中發(fā)揮重要作用。然而Keap1-Nrf2-ARE信號通路在腎間質(zhì)纖維化中的作用尚未見報道。丁苯肽是一種抗氧化應(yīng)激藥物，廣泛用于缺血性腦損傷的治療，但目前關(guān)于丁苯酞在梗阻性腎病小鼠模型中抗氧化應(yīng)激作用的研究在國內(nèi)尚無報道。本課題通過建立單側(cè)輸尿管結(jié)扎致梗阻性腎病小鼠模型，觀察丁苯酞對梗阻性腎病小鼠腎間質(zhì)纖維化的保護作用，并通過與貝那普利進行對照觀察其

3、療效，以進一步探討其作用機理。
　　方法:清潔級CD-1小鼠72只（雄性），將小鼠隨機分為4組:假手術(shù)組(Sham)、模型組(UUO)、治療組(NBP)、對照組(ACEI)。假手術(shù)組、模型組均給予等量生理鹽水灌胃。治療組、對照組分別給予丁苯酞180mg/kg/d、貝那普利5mg/kg/d灌胃。實驗期間動物自由攝食水，每天注意觀察小鼠的一般狀況，有無飲食及活動異常。各組分別于術(shù)后第3、7、14天處死6只小鼠，取梗阻側(cè)腎組織。用0.9

4、％鹽水充分清洗后放入10％中性福爾馬林固定，待做病理切片、免疫組化染色;把另取部分腎組織放入液氮使組織迅速冷凍，防止蛋白降解，-70℃保存待測western blot。再另剩余腎組織用DEPC水處理使RNA酶滅活后移入液氮使組織迅速冷凍，最后-70℃超低溫保存待做RT-PCR實驗;所有實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，P＜0.05認為是組間有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　結(jié)果:
　　1小鼠腎臟組織病理改變
　　

5、1.1肉眼:解剖后用肉眼觀察假手術(shù)組腎臟顏色及大小正常，其余各組小鼠腎臟均有不同程度增大，其中尤以模型組腎臟增大最為明顯，治療組及對照組腎臟外觀大體變化均較模型組輕。
　　1.2光鏡:
　　1.2.1 HE染色
　　觀察模型組小鼠腎小管上皮細胞有脫落、空泡樣變性，其間質(zhì)有炎細胞浸潤，呈彌漫性，偶有間質(zhì)纖維化，觀察腎小管有擴張、萎縮、塌陷，其基底膜結(jié)構(gòu)不完整，隨著梗阻時間的延長，間質(zhì)、腎小管的結(jié)構(gòu)基本消失;而腎小球病變程

6、度不一。假手術(shù)組小鼠腎組織結(jié)構(gòu)正常，無異常改變，亦無纖維組織增生。治療組與模型組比較有不同程度的減輕。其與對照組相比，對照組病變程度介于治療組、模型組之間。
　　1.2.2 Masson染色
　　模型組Masson染色顯示腎間質(zhì)較前增寬，間質(zhì)組織、細胞較前增多，并存在腎小管廣泛擴張，腎間質(zhì)、腎小球內(nèi)有大量膠原纖維，并且可見膠原纖維逐漸向腎組織周圍延伸，并且相互交織成“網(wǎng)狀”。假手術(shù)組顯示腎組織相對完整，腎細胞排列比較規(guī)則，結(jié)

7、構(gòu)尚清晰，僅個別有少量膠原纖維。治療組與模型組比較有不同程度的減輕。其與對照組相比，對照組病變程度介于治療組、模型組之間。
　　2免疫組化結(jié)果
　　Nrf2在正常腎組織中僅散在表達于腎小管上皮細胞中，從圖像分析結(jié)果可以看出，3天時治療組小鼠腎組織Nrf2呈陽性，并且隨著輸尿管梗阻時間的延長，Nrf2表達逐漸增強，至7天、14天時與模型組比較，有顯著性差異(P＜0.05)，分別為7天治療組與模型組比較（0.1973±0.029

8、4）vs(0.1579±0.0076)、14天治療組與模型組比較（0.2722±0.0338）vs（0.1152±0.0128）;且丁苯肽組Nrf2表達（0.2722±0.0338）強于貝那普利組（0.2104±0.0358），二者統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)具有顯著意義(P＜0.05）。
　　γ-GCS主要在腎小球和皮質(zhì)腎小管上皮細胞內(nèi)表達，在髓質(zhì)腎小管僅有少量分布。從圖片及圖像分析結(jié)果可以看出，3天時治療組小鼠腎組織γ-GCS呈陽性，并且隨著輸

9、尿管梗阻時間的延長，γ-GCS表達逐漸增強，至7天、14天時與模型組比較表達明顯增加(P＜0.05）;7天時治療組與模型組比較（0.1487±0.0207）vs(0.1035±0.0021)，14天時治療組與模型組比較為（0.3009±0.0366）vs(0.0729±0.0039)，且丁苯肽組γ-GCS表達強于貝那普利組。分別為（0.3009±0.0366）vs(0.2255±0.0436)，兩組間比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05）。<

10、br>　　Ⅰ型膠原蛋白正常情況下在腎小管上皮細胞、間質(zhì)細胞及腎小球系膜細胞胞漿中有少量表達，在胞漿內(nèi)出現(xiàn)淺棕色顆粒呈弱陽性表達。從圖片及圖像分析結(jié)果可看出，Ⅰ型膠原蛋白在假手術(shù)組有極少量表達。3天后模型組小鼠較治療組（0.1089±0.0055）vs（0.1527±0.0339）明顯升高（P＜0.05），并且以后隨著梗阻時間的延長，病變進一步加重，Ⅰ型膠原蛋白表達逐漸增多，至14天時表達達到高峰。治療組小鼠在各時間點較模型組表達顯著減少

11、(P＜0.05)。
　　3 RT-PCR結(jié)果
　　RT-PCR檢測Nrf-2 mRNA結(jié)果顯示:與同期假手術(shù)組相比，術(shù)后3、7、14天模型組小鼠腎組織中Nrf-2mRNA表達均增加，給予丁苯肽干預(yù)后，在第7、14天治療組與模型組相比，小鼠中Nrf-2表達均增加（P＜0.05），7天時治療組與模型組比較（0.4917±0.0129）vs(0.3554±0.0274)(P＜0.05)，14天時治療組與模型組比較為（0.5205±

12、0.0165）vs(0.3648±0.0101)（P＜0.05）。丁苯肽組Nrf-2表達強于貝那普利組，于第14天分別為(0.5205±0.0165) vs(0.4246±0.0097)，二者統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)具有顯著意義(P＜0.05)。
　　RT-PCR檢測γ-GCSmRNA結(jié)果顯示:與同期假手術(shù)組相比，術(shù)后3、7、14天模型組小鼠腎組織中γ-GCSmRNA表達均增加，給予丁苯肽干預(yù)后，與同期模型組相比，治療組小鼠中γ-GCSmRNA

13、表達均增加。7天時治療組與模型組比較（0.5731±0.0205）vs(0.4519±0.0149)(P＜0.05)，14天時治療組與模型組比較為（0.7186±0.0342）vs(0.4855±0.0117)(P＜0.05)。丁苯肽組γ-GCS表達強于貝那普利組，于第14天分別為(0.5205±0.0165) vs(0.4246±0.0097)，二者統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)具有顯著意義(P＜0.05)。
　　RT-PCR檢測結(jié)果顯示:與同期假

14、手術(shù)組相比，術(shù)后3、7、14天模型組小鼠腎組織中Ⅰ型膠原蛋白mRNA表達均增多（P＜0.05），給予丁苯肽干預(yù)后，至7天、14天時與模型組比較表達減少，兩組間比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。4 western結(jié)果
　　Western實驗Nrf-2蛋白的表達:與同期假手術(shù)組相比，術(shù)后7、14天模型組Nrf-2蛋白表達均增加(P＜0.05)，7天時治療組與模型組比較（0.6143±0.0118）vs(0.3522±0.0065)，1

15、4天時治療組與模型組比較為（0.7027±0.0218）vs(0.3356±0.0030)。各組間均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。且14天較7天更為顯著。丁苯肽組Nrf-2表達強于貝那普利組，于第7天分別為(0.6143±0.0118) vs(0.4450±0.0107)，于第14天分別為(0.7027±0.0218) vs(0.4531±0.0054)，二者統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)具有顯著意義（P＜0.05）。
　　westem實驗γ-GCS

16、蛋白的表達:與同期假手術(shù)組相比，術(shù)后7、14天模型組γ-GCS蛋白表達均增加(P＜0.05)，7天時治療組與模型組比較(0.6843±0.0147) vs(0.3268±0.0099)，14天時治療組與模型組比較為（1.0053±0.0113）vs(0.4589±0.0145)。各組間均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。且14天較7天更為顯著。丁苯肽組γ-GCS表達強于貝那普利組，于第7天分別為(0.6843±0.0147) vs(0.38

17、63±0.0097)，于第14天分別為(1.0053±0.0113) vs(0.7232±0.0063)，二者統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)具有顯著意義(P＜0.05)。
　?、裥湍z原蛋白western結(jié)果顯示:與同期假手術(shù)組相比，術(shù)后7、14天模型組小鼠腎組織中Ⅰ型膠原蛋白表達均增多(P＜0.05)，給予丁苯肽干預(yù)后，至7天、14天時與模型組比較表達減少;7天時治療組與模型組比較(0.5649±0.0064)vs(0.9681±0.0109)，14

18、天時治療組與模型組比較為（0.4392±0.0077）vs(1.1199±0.0902)，兩組間比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　1在腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生、進展過程中Keap1-Nrf2-ARE信號通路起到了保護作用，并進一步證實Nrf2、r-GCS能延緩腎間質(zhì)纖維化的進展。
　　2丁苯肽有抗腎間質(zhì)纖維化作用，機理可能與激活Keap1-Nrf2-ARE信號通路，提高腎間質(zhì)中Nrf-2、抗氧化酶r-GCS