7,8-二羥基黃酮對(duì)缺氧誘導(dǎo)下腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的抑制作用.pdf

1、目的：觀察7,8-二羥基黃酮（7,8-dihydroxyflavone，7,8-DHF）對(duì)缺氧誘導(dǎo)的人近端腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（Endoplasmic reticulum stress，ERS）損傷的影響，并初步探討其可能的分子機(jī)制。
　　方法：體外培養(yǎng)人近端腎小管上皮細(xì)胞（HK-2），采用缺氧培養(yǎng)箱建立細(xì)胞缺氧損傷模型，排除含血清培養(yǎng)基對(duì)缺氧的影響后，實(shí)驗(yàn)分為5組，分別為缺氧0h、4h、8 h、12 h、16 h組。實(shí)時(shí)熒光

2、定量PCR（RT-PCR）法篩選缺氧誘導(dǎo)ERS的最佳缺氧時(shí)間。用不同濃度（50、100、150、200、250μmol/L）7,8-DHF處理HK-2細(xì)胞,采用細(xì)胞增殖與活性實(shí)驗(yàn)篩選7,8-DHF的安全濃度。用7,8-DHF預(yù)處理HK-2細(xì)胞缺氧模型，按如下處理因素分組：對(duì)照組、缺氧+DMSO組、缺氧+7,8-DHF組（包括100μmol/L組和150μmol/L組），通過檢測細(xì)胞增殖與活性篩選最佳給藥濃度。后將細(xì)胞隨機(jī)分為缺氧組、缺氧

3、+7,8-DHF組（100μmol/L），Western印跡法檢測細(xì)胞蛋白激酶（Akt）、磷酸化蛋白激酶（p-Akt）、富含半胱氨酸蛋白61（Cysteine-rich protein61，Cyr61）、ERS相關(guān)促凋亡蛋白CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白（CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein，CHOP）的表達(dá)。用重組Cyr61慢病毒載體構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)Cyr61蛋白的Cyr61-HK-

4、2細(xì)胞株進(jìn)行缺氧實(shí)驗(yàn)，按如下處理因素分組：缺氧+空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，缺氧+Cyr61過表達(dá)組，采用膜連蛋白V和碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）染色后采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，Western印跡檢測Cyr61和CHOP蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：（1）與正常培養(yǎng)組細(xì)胞相比，RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示12 h為誘導(dǎo)ERS的最佳缺氧時(shí)間（P＜0.01）。（2）與對(duì)照組相比，細(xì)胞增殖與活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示100μmol/L的7,8-D

5、HF組為最佳給藥濃度（P＜0.01）。（3）與缺氧+DMSO組相比，7,8-DHF預(yù)處理HK-2細(xì)胞，p-Akt、Cyr61表達(dá)量均明顯增高（P＜0.05），CHOP表達(dá)量明顯降低（P＜0.05）；LY294002處理可抑制p-Akt的表達(dá)，減少Cyr61及增加CHOP的表達(dá)（均 P＜0.05）。（4）與缺氧+空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比，過表達(dá) Cyr61組細(xì)胞的凋亡率明顯降低（P＜0.01）。（5）與缺氧+空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比，過表達(dá)Cyr61組的