緊密連接在尿酸鈉結(jié)晶誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中的作用.pdf

1、長(zhǎng)期以來(lái)高尿酸血癥（Hyperuricemia HUA）僅僅被認(rèn)為是代謝異常的一種標(biāo)志,臨床上高尿酸血癥患者多伴有腎臟病、高血壓、心血管疾病、糖尿病等疾病出現(xiàn)。雖然對(duì)于高尿酸血癥在這些疾病中是一個(gè)病因抑或僅僅是一個(gè)“標(biāo)志”存在爭(zhēng)論，但更多證據(jù)表明，高尿酸血癥本身對(duì)腎臟和心血管系統(tǒng)有直接損傷作用，是腎臟疾病和心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。
　　尿酸或尿酸鹽引起腎臟損傷除了尿酸鹽結(jié)晶導(dǎo)致的梗阻外，尿酸致腎臟病機(jī)制主要包括腎小球入球小動(dòng)脈微

2、血管病變、腎臟炎癥反應(yīng)以及激活腎素-血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin system，RAS）、活化環(huán)氧酶-2（cyclooxygenase2,COX-2）。尿酸結(jié)晶還可以激活補(bǔ)體系統(tǒng)，啟動(dòng)炎癥反應(yīng)，刺激腎小管上皮細(xì)胞合成前列腺素 E2(PGE2)和單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1），使局部炎癥反應(yīng)放大，最終導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化，甚至腎衰竭。
　　眾所周知，細(xì)胞與細(xì)胞之間的聯(lián)系通過(guò)一些連接裝置實(shí)現(xiàn)，包括緊密連接（Tig

3、ht junction，TJ）、粘附連接（Adherens junction，AJ）、縫隙連接（Gap junction）、橋粒連接（Desmosome junction）。其中緊密連接（TJ）是指上皮細(xì)胞頂端側(cè)面質(zhì)膜中的密封蛋白和封閉蛋白在細(xì)胞間構(gòu)成的密封連接，對(duì)于維持表皮和內(nèi)皮細(xì)胞的選擇滲透性屏障功能起關(guān)鍵作用。
　　緊密連接是一動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)，由跨膜蛋白（occludin、claudins）和膜周蛋白（ZO-1，ZO-2，ZO

4、-3）組成。TJ除機(jī)械連接作用外，還有兩個(gè)主要功能：一是“門(mén)（gate）”功能，封閉細(xì)胞頂部的細(xì)胞間隙，隔絕機(jī)體內(nèi)外環(huán)境；隔絕機(jī)體局部?jī)?nèi)環(huán)境，控制細(xì)胞旁路的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。二是“藩籬（fence）”功能，維持細(xì)胞極性；調(diào)控細(xì)胞增殖和分化；參與上皮細(xì)胞EMT過(guò)程。
　　多種因素如氧化應(yīng)激、病原體、促炎癥細(xì)胞因子等均可破壞緊密連接蛋白結(jié)構(gòu)及功能，緊密連接的破壞涉及多種疾病，包括胃腸道、肺及腎臟疾病等。Paleerath等提出草酸鈣結(jié)晶可破壞

5、緊密連接屏障功能及藩籬功能，一定程度上提出了TJ在腎結(jié)石引起腎間質(zhì)纖維化中的作用。但目前研究來(lái)看，尿酸性結(jié)石與緊密連接蛋白及腎間質(zhì)纖維化的關(guān)系仍未明確，有待進(jìn)一步研究。
　　一、研究目的
　　1．探討尿酸鈉結(jié)晶（MSU）對(duì)腎小管上皮細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1、Occludin的表達(dá)、分布及功能的影響；
　　2．探討尿酸鈉結(jié)晶對(duì)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響。
　　二、方法
　　無(wú)血清培養(yǎng)基同步化NRK-52E細(xì)胞

6、24小時(shí)后，加MSU刺激細(xì)胞：
　　1．MTT法觀察MSU（100μg/ml，300μg/ml，500μg/ml，700μg/ml）刺激NRK-52E細(xì)胞24h，及MSU500μg/ml刺激NRK-52E細(xì)胞24h、48h、72h，細(xì)胞活性的變化；
　　2．倒置相差顯微鏡下觀察MSU對(duì)NRK-52E細(xì)胞形態(tài)改變的影響；
　　3．免疫熒光法檢測(cè)ZO-1、E-cad、α-SMA的分布及表達(dá)；
　　4．RT-PCR法檢

7、測(cè)ZO-1 mRNA、Occludin mRNA、E-cad mRNA、α-SMA mRNA的表達(dá)。
　　三、結(jié)果
　　1．MTT檢測(cè)MSU對(duì)細(xì)胞活力的影響
　　1.1．不同濃度MSU（100μg/ml，300μg/ml，500μg/ml，700μg/ml）刺激NRK-52E細(xì)胞24h，細(xì)胞活性分別下降至正常對(duì)照組的89.13±7.7％；85.60±12%；78.54±13%；47.82±14%，（P<0.05）；

8、r>　　1.2．MSU（500μg/ml）刺激NRK-52E細(xì)胞24h、48h、72h，細(xì)胞活性分別降至正常對(duì)照組的69.79±8.34%；66.43±10.15%；65.73±10.05%，（p<0.05）。
　　2．MSU對(duì)細(xì)胞形態(tài)改變的影響
　　倒置相差顯微鏡下觀察不同時(shí)相，MSU（500μg/ml）刺激 NRK-52E細(xì)胞引起的細(xì)胞形態(tài)變化：
　　2.1、空白對(duì)照組 NRK-52E細(xì)胞在培養(yǎng)板中呈圓形或卵圓形，

9、具有典型的上皮細(xì)胞鋪路石樣形態(tài)學(xué)特征，各時(shí)相細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯改變。
　　2.2、與空白對(duì)照組相比，MSU誘導(dǎo)NRK-52E細(xì)胞24h后，細(xì)胞形態(tài)未見(jiàn)明顯改變；培養(yǎng)48h后，細(xì)胞肥大，逐漸失去典型的鋪路石樣形態(tài)；培養(yǎng)72h后，細(xì)胞變長(zhǎng)呈梭形，失去鋪路石樣外觀，具有成纖維細(xì)胞特性。
　　3．間接免疫熒光檢測(cè)MSU對(duì)ZO-1、E-cad、α-SMA蛋白表達(dá)及分布情況
　　緊密連接蛋白（ZO-1）及E鈣黏素蛋白（E-cad）主要

10、在細(xì)胞膜表達(dá)；a平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）以胞漿表達(dá)為主，正常細(xì)胞表達(dá)量少，甚至不表達(dá)。
　　MSU（500μg/ml）刺激NRK-52E細(xì)胞24h、48h、72h，免疫熒光顯示ZO-1、E-cad熒光強(qiáng)度下降，隨著MSU作用時(shí)間的增加，ZO-1、E-cad的熒光強(qiáng)度逐漸下降，且細(xì)胞膜蛋白出現(xiàn)斷裂分布現(xiàn)象，以72h作用明顯；
　　MSU（500μg/ml）刺激NRK-52E細(xì)胞24h、48h、72h，免疫熒光顯示隨著MSU

11、作用時(shí)間增加，α-SMA熒光表達(dá)逐漸增強(qiáng)。
　　4. RT-PCR檢測(cè) MSU對(duì)NRK52E細(xì)胞 ZO-1 mRNA、Occludin mRNA、E-cadmRNA、α-SMA mRNA表達(dá)的影響
　　正常 NRK-52E細(xì)胞可表達(dá)較為豐富的ZO-1 mRNA、Occludin mRNA、E-cadmRNA或表達(dá)少量α-SMA mRNA。與正常對(duì)照組相比，MSU（500μg/ml）刺激NRK-52E細(xì)胞24h、48h、72h

12、時(shí)，ZO-1、Occludin和E-cad mRNA表達(dá)降低（p<0.05）,72h下降明顯(p<0.01）；而α-SMA mRNA表達(dá)量各時(shí)相均高于正常對(duì)照組（P<0.05）,72h時(shí)升高明顯(p<0.01）。
　　結(jié)論：
　　1．尿酸鈉晶體（MSU）作用于腎小管上皮細(xì)胞，可導(dǎo)致緊密連接蛋白（ZO-1、Occludin）表達(dá)降低、分布異常及細(xì)胞與細(xì)胞間連接功能破壞。
　　2．MSU誘導(dǎo)NRK-52E細(xì)胞緊密連接蛋白表