三七總皂甙對(duì)馬兜鈴酸Ⅰ誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的：馬兜鈴酸腎病是由于服用含有馬兜鈴酸(aristolochic acid,AA)的中草藥所致。其主要機(jī)制是直接損害腎小管上皮細(xì)胞，使其發(fā)生轉(zhuǎn)分化、壞死或凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化。腎小管間質(zhì)纖維化是各種慢性、進(jìn)展性腎臟疾病發(fā)展為終末期腎功能衰竭的共同通路，其主要病理改變?yōu)槟I小管上皮細(xì)胞減少、細(xì)胞外基質(zhì)積聚和一定階段內(nèi)間質(zhì)中出現(xiàn)較多的肌成纖維細(xì)胞。研究表明，腎小管上皮細(xì)胞-肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(tubular epithelial-my

2、ofibriblast transdifferentiation，TEMT)可能是馬兜鈴酸所致腎間質(zhì)纖維化的主要原因；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是致腎間質(zhì)纖維化的主要細(xì)胞因子；馬兜鈴酸誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化與TGF-β1有關(guān)，但對(duì)其下游作用機(jī)制尚不十分清楚。三七總皂甙(total saponins of panax notoginseng，PNS)是三七的主要成分，

3、可通過多種機(jī)制防治肝和腎纖維化的發(fā)展。 本研究擬通過建立馬兜鈴酸誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的體外模型，探討馬兜鈴酸誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過程中對(duì)TGF-β1及其下游介質(zhì)結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor,CTGF)表達(dá)的影響，以及PNS是否能抑制馬兜鈴酸誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化及其作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用PNS治療慢性馬兜鈴酸腎病提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：將HK-2細(xì)胞與不同濃

4、度(0，10，20，40，60，80μg/ml)的AA Ⅰ共同培養(yǎng)48h后，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性；免疫組織化學(xué)方法測(cè)定肌成纖維細(xì)胞特異性標(biāo)志物α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的表達(dá)。在建立AA Ⅰ誘導(dǎo)體外培養(yǎng)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化模型的基礎(chǔ)上，將HK-2細(xì)胞分為6個(gè)組，分別為空白對(duì)照組、PNS對(duì)照組、AA Ⅰ誘導(dǎo)組、不同劑量(200，400，600μg/ml)PNS治療組。每組分別培養(yǎng)至

5、24 h、48 h、72 h時(shí)，應(yīng)用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)；免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)α-SMA的表達(dá)；EUSA法測(cè)定培養(yǎng)細(xì)胞上清液中TGF-β1的含量；RT-PCR法檢測(cè)CTGFmRNA表達(dá)。 結(jié)果： 1.HK-2細(xì)胞與AA Ⅰ共培養(yǎng)48 h后，與對(duì)照組比較40、60、80 μg/ml AA Ⅰ組OD值減小(P<0.05)；AA Ⅰ誘導(dǎo)組細(xì)胞表達(dá)α-SMA隨AA Ⅰ的濃度增加而增加，60、80 μg/ml AA Ⅰ組細(xì)胞

6、大量表達(dá)α-SMA，但有部分細(xì)胞壞死、脫落。 2.與空白對(duì)照組比較， AA Ⅰ誘導(dǎo)組細(xì)胞培養(yǎng)48 h、72 h后從原有典型的上皮細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)殚L(zhǎng)梭形肌成纖維細(xì)胞形態(tài)；免疫組織化學(xué)染色見胞漿內(nèi)大量表達(dá)α-SMA，其積分光密度值增加，差異具有顯著性(P<0.05)：CTGFmRNA表達(dá)相對(duì)量較同期對(duì)照組增加(P<0.05)； AA Ⅰ誘導(dǎo)組細(xì)胞培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，上清液中TGF-β1含量均增加，且呈時(shí)間依賴性(P<0

7、.05)。 3.PNS對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，細(xì)胞形態(tài)學(xué)、α-SMA、CTGFmRNA表達(dá)及TGF-β1分泌量與同期空白對(duì)照組比較差異無顯著性(P>0.05)。 4.不同劑量PNS治療組，細(xì)胞培養(yǎng)48 h、72 h后，馬兜鈴酸誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變減輕；α-SMA表達(dá)IOD值和CTGFmRNA表達(dá)相對(duì)量較誘導(dǎo)組下降，且呈劑量依賴性(P<0.05)；細(xì)胞培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，PNS

8、不同程度地抑制TGF-β1分泌，且呈劑量依賴性(P<0.05)。 5.相關(guān)分析顯示，α-SMA表達(dá)IOD值與TGF-β1的分泌量呈正相關(guān)(r=0.784，P＜0.05)，與CTGFmRNA表達(dá)相對(duì)量亦呈正相關(guān)(r=0.916，P＜0.05)，且CTGFmRNA表達(dá)相對(duì)量與TGF-β1的分泌量呈正相關(guān)(r=0.829，P＜0.05)。 結(jié)論： 1.建立 AA I誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞轉(zhuǎn)分化模型的最佳藥物濃度為20μg/m