自體富血小板血漿對(duì)兔膝關(guān)節(jié)軟骨損傷修復(fù)作用的研究.pdf

1、目的:關(guān)節(jié)軟骨是一種特殊的致密結(jié)締組織，其表面光滑，具有獨(dú)特的生物學(xué)性能，可以使其有效的傳輸和分散負(fù)荷，從而能減少相鄰兩骨接觸面的摩擦力，緩沖運(yùn)動(dòng)時(shí)所產(chǎn)生的震動(dòng)。關(guān)節(jié)軟骨可以在退行性骨關(guān)節(jié)病或者暴力損傷等過(guò)程中被破壞，從而引起關(guān)節(jié)軟骨損傷。由于缺乏血管而且軟骨細(xì)胞為終末分化細(xì)胞，所以軟骨自身的修復(fù)能力極差，損傷很難自愈，尤其是未達(dá)到軟骨下骨的損傷。傳統(tǒng)的治療軟骨損傷的方法有保守治療和手術(shù)治療兩種，保守治療即口服非甾體抗炎藥物或關(guān)節(jié)內(nèi)注射

2、玻璃酸鈉等，此種方法只是延緩了關(guān)節(jié)軟骨損傷的進(jìn)一步發(fā)展的速度，緩解疼痛程度，并沒有從根本上解決關(guān)節(jié)軟骨損傷問(wèn)題;手術(shù)治療則對(duì)手術(shù)指證要求比較嚴(yán)格并且遠(yuǎn)期療效并不理想。為了探索治療關(guān)節(jié)軟骨損傷的新方法，本實(shí)驗(yàn)研究通過(guò)對(duì)18只兔雙膝關(guān)節(jié)進(jìn)行軟骨損傷造模后關(guān)節(jié)內(nèi)注入PRP，了解PRP在軟骨損傷修復(fù)過(guò)程中是否有促進(jìn)作用，并對(duì)其修復(fù)組織進(jìn)行大體觀察及顯微鏡下觀察，確定新生組織成分，進(jìn)一步探討PRP在促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨損傷修復(fù)過(guò)程中的作用。
　　

3、 方法:1、分組:實(shí)驗(yàn)用3-4月齡新西蘭大白兔18只，隨機(jī)分為三組，每組6只。三組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分別于術(shù)后第1、3、5周處死，命名為1周組、3周組、5周組。全部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物左膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)髁軟骨為對(duì)照側(cè)，右膝內(nèi)側(cè)髁軟骨為實(shí)驗(yàn)側(cè)，進(jìn)行自身對(duì)照。
　　 2、采血:每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均于耳中心動(dòng)脈處緩慢抽取約7-8ml動(dòng)脈血，其中5ml注入肝素鋰抗凝的真空采血管中，2ml注入EDTA-K2抗凝的真空采血管中，備用。
　　 3、PRP的制備:應(yīng)用二

4、次離心法制備PRP，第一次離心轉(zhuǎn)速2000r/min，時(shí)間10min，離心后注射器吸取交界層以下2mm的紅細(xì)胞并棄去，剩余部分放入離心機(jī)中配平后進(jìn)行第二次離心，轉(zhuǎn)速2000r/min，時(shí)間10min，離心后用注射器吸取血清層的上方3/4部分并棄去，剩余部分即為PRP。5ml兔動(dòng)脈血可制備約0.5mlPRP。
　　 4、血小板計(jì)數(shù):將采血時(shí)得到的EDTA-K2抗凝的2ml血液以及制成的PRP放入血細(xì)胞分析儀中進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)。

5、>　　 5、軟骨損傷造模及干預(yù):每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均采用膝前正中切口切開膝關(guān)節(jié)前方皮膚后以髕旁內(nèi)側(cè)入路切開膝關(guān)節(jié)囊，充分暴露兔膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)髁后用手術(shù)刀片在其內(nèi)側(cè)髁正中部位制造大小約2×3mm、厚度約0.3mm的軟骨缺損，然后，右膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注入之前制備的0.5mlPRP及50ul激活劑（葡萄糖酸鈣、牛凝血酶）左膝不予其他干預(yù)處理。術(shù)后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均不予以制動(dòng)。
　　 6、觀察結(jié)果:空氣栓塞法處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物后切開關(guān)節(jié)囊暴露軟骨損傷部位進(jìn)行大體觀

6、察并應(yīng)用國(guó)際軟骨修復(fù)協(xié)會(huì)(InternationalCartilageRepairSocietyICRS)對(duì)其進(jìn)行大體評(píng)價(jià)，之后對(duì)損傷修復(fù)部位進(jìn)行取材制成組織切片并行HE和番紅-O染色，對(duì)其進(jìn)行顯微鏡下觀察并應(yīng)用奧德里斯科爾組織學(xué)評(píng)分(O'Driscollhistologicalscore)對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　 結(jié)果:在1周時(shí)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組已有顯著差異，實(shí)驗(yàn)組已可觀察到軟骨損傷區(qū)表面有一層薄膜樣組織生成，番紅-O染色后顯微鏡下觀

7、察可見實(shí)驗(yàn)組軟骨損傷處有大量軟骨細(xì)胞增生聚集，但并無(wú)軟骨基質(zhì)形成，而對(duì)照組新生的細(xì)胞大部分為成纖維細(xì)胞;在3周時(shí)肉眼觀察實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組軟骨缺損區(qū)可發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組修復(fù)程度顯著優(yōu)于對(duì)照組，顯微鏡下觀察結(jié)果也顯示實(shí)驗(yàn)組已有大量番紅-O著色的軟骨基質(zhì)，軟骨細(xì)胞增殖旺盛，而對(duì)照組則缺乏軟骨基質(zhì)產(chǎn)生，新生的細(xì)胞多為成纖維細(xì)胞。在5周時(shí)大體觀察可見實(shí)驗(yàn)組軟骨缺損區(qū)已經(jīng)完全修復(fù)，幾乎看不到軟骨損傷痕跡，而對(duì)照組軟骨缺損仍然明顯，相比較與3周組的軟骨缺損修復(fù)

8、程度沒有明顯提高，在顯微鏡下觀察見實(shí)驗(yàn)組新生組織與正常軟骨組織從細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞分布及細(xì)胞外基質(zhì)分布方面都沒有明顯區(qū)別，對(duì)照組則仍然幾乎沒有軟骨基質(zhì)形成。
　　 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均應(yīng)用秩和檢驗(yàn)，大體觀察評(píng)分結(jié)果顯示1周組中實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組對(duì)比Z=-2.220,P=0.026(＜0.05)，3周組中實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組對(duì)比Z=-2.214，P=0.027(＜0.05)，5周組中實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組對(duì)比Z=-2.333,P=0.020＜0.05)，差異均

9、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;顯微鏡下觀察評(píng)分結(jié)果顯示1周組中實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組對(duì)比Z=-2.460,P=0.014(＜0.05)，3周組中實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組對(duì)比Z=-2.530,P=0.011＜0.05)，5周組中實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組對(duì)比Z=-2.646,P=0.008(＜0.05)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論:通過(guò)本實(shí)驗(yàn)我們認(rèn)為:關(guān)節(jié)軟骨損傷后自身修復(fù)緩慢，并且新生組織為纖維軟骨，PRP可促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨損傷后的修復(fù)速度，并且能刺激軟骨細(xì)胞再生基質(zhì)形成