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文檔簡介
1、目的:研究2,3,7,8-四氯二苯并二噁英(2,3,7,8-tetrachlorodibenzodioxin,TCDD)所致先天性腎積水的發(fā)生機制,以及槲皮素對先天性腎積水的預(yù)防作用。 方法:1.利用TCDD誘導(dǎo)建立小鼠先天性腎積水動物模型。在C57BL/6J孕鼠第12個妊娠日(gestational day,GD),實驗組以TCDD(25μg/kg)灌胃,對照組以玉米油灌胃。GD18,統(tǒng)計胎鼠數(shù)及存活率;解剖胎鼠,觀察畸形發(fā)生
2、情況。對孕鼠及胎鼠的各主要臟器進行組織學(xué)檢查,并對胎鼠的腎臟及輸尿管進行超微結(jié)構(gòu)觀察。 2.采用比較蛋白質(zhì)組學(xué)方法探討TCDD致小鼠先天性腎積水的分子機制。GD12,TCDD組C57BL/6J孕鼠以TCDD(25μg/kg)灌胃,對照組孕鼠以玉米油灌胃。GD18,取胎鼠上尿路,提取組織總蛋白,進行雙向凝膠電泳,圖像分析兩組間差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點,將差異明顯的蛋白質(zhì)點進行質(zhì)譜分析后于數(shù)據(jù)庫中檢索鑒定,并應(yīng)用免疫組化方法對鑒定出的蛋白
3、質(zhì)進行驗證。體外培養(yǎng)GD12的胎鼠泌尿系統(tǒng),Prx1組加peroxiredoxin1(Prx1)蛋白(終濃度為1:100),對照組加等量培養(yǎng)基,培養(yǎng)6天后,進行組織學(xué)檢查,了解輸尿管粘膜上皮增殖情況及輸尿管管腔有無狹窄。 3.觀察槲皮素對小鼠先天性腎積水的預(yù)防作用。GD12,C57BL/6J孕鼠隨機分為四組:對照組以玉米油灌胃,TCDD組以TCDD(25μg/kg)灌胃,槲皮素組以槲皮素(100 mg/kg)灌胃,TCDD+槲皮
4、素組以槲皮素(100 mg/kg)及TCDD(25μg/kg)灌胃。GD18,統(tǒng)計胎鼠數(shù)及存活率,檢查畸形發(fā)生情況,并留取胎鼠泌尿系統(tǒng)作組織學(xué)觀察及免疫組化檢測。 結(jié)果:1.實驗組胎鼠雙側(cè)腎積水及上段輸尿管積水發(fā)生率為100%(3級腎積水為86.2%,4級腎積水為13.8%)。實驗組胎鼠腎間質(zhì)纖維化,中下段輸尿管粘膜移行上皮增生,管腔變窄,腎小管上皮細(xì)胞腫脹,結(jié)構(gòu)模糊,可見膜性結(jié)構(gòu)破裂,輸尿管上皮細(xì)胞核大,核仁明顯,靠邊,染色質(zhì)
5、豐富,常染色質(zhì)發(fā)達(dá),異染色質(zhì)少。對照組胎鼠腎臟及輸尿管未見異常。實驗組胎鼠腎積水發(fā)生率高于對照組(P<0.01)。 2.經(jīng)雙向電泳、質(zhì)譜分析及數(shù)據(jù)庫查詢后,最終在腎積水胎鼠上尿路中鑒定出12種表達(dá)增強的蛋白質(zhì),分別是:Prx1蛋白、鈣粘蛋白6、γ-肌動蛋白、根蛋白、結(jié)蛋白、Ⅱ型轉(zhuǎn)化生長因子β受體、嗜鉻顆粒蛋白B、血清白蛋白前體、轉(zhuǎn)鐵蛋白、假說蛋白LOC70984、Lipk蛋白和鋅指蛋白336。免疫組化結(jié)果顯示,Prx1蛋白在腎積
6、水胎鼠輸尿管粘膜上皮表達(dá)增強。經(jīng)體外培養(yǎng)6天后,與對照組相比,Prx1組輸尿管粘膜上皮增生明顯,上皮層增厚,輸尿管管腔狹窄(P<0.01)。 3.槲皮素對小鼠先天性腎積水的預(yù)防作用。各組孕鼠每日體重增長無顯著差異(P>0.05),一般情況正常,無流產(chǎn)及早產(chǎn),產(chǎn)仔數(shù)無顯著差異(P>0.05);各組胎鼠體重?zé)o顯著差異(P>0.05),均為活胎,無死胎及吸收胎。對照組及槲皮素組胎鼠無腎盂及上段輸尿管積水發(fā)生。TCDD組胎鼠雙側(cè)腎盂及上
7、段輸尿管積水發(fā)生率為100%(3級腎積水84.1%,4級腎積水15.9%),TCDD+槲皮素組為13.4%(均為3級腎積水),差異具有顯著性(P<0.05)。免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果:對照組與槲皮素組胎鼠輸尿管粘膜上皮Prx1蛋白均呈陰性表達(dá);在TCDD組及TCDD+槲皮素組具有腎積水的胎鼠輸尿管粘膜上皮呈陽性表達(dá)。TCDD組胎鼠輸尿管粘膜上皮Prx1蛋白陽性表達(dá)率(100%)高于TCDD+槲皮素組(13.4%),差異具有顯著性(P<0.0
8、5)。 結(jié)論:1.TCDD誘導(dǎo)出的C57BL/6J胎鼠雙側(cè)腎積水動物模型在病理學(xué)表現(xiàn)上與人類腎盂輸尿管連接處梗阻(ureteropelvic junction obstruction,UPJO)相似,適用于UPJO的病因?qū)W及發(fā)病機制等方面的研究。 2.TCDD致胎鼠腎積水的分子機制與Prx1蛋白密切相關(guān):TCDD通過誘導(dǎo)胎鼠氧化應(yīng)激,使Prx1蛋白反應(yīng)性升高以對抗氧化應(yīng)激,同時刺激輸尿管粘膜上皮增生,致使其管腔變窄,產(chǎn)生
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