2，3，7，8-四氯二苯并對(duì)二噁英對(duì)體外培養(yǎng)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞E-,2-、P分泌和氧化應(yīng)激及凋亡的影響.pdf

1、近年，越來(lái)越多的流行病學(xué)研究資料表明野生動(dòng)物和人類的生殖發(fā)育系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和行為異常以及某些腫瘤的發(fā)生率上升與環(huán)境內(nèi)分泌干擾物有關(guān)。其中2，3，7，8-四氯二苯并對(duì)二噁英(2，3，7，8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxinTCDD)毒性最大，在痕量(如人體每日攝入量為1-4pg／kg體重或更低)暴露劑量下便干擾整個(gè)機(jī)體的內(nèi)分泌調(diào)節(jié)、損傷免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、誘發(fā)癌癥等毒性作用，尤其具有雌激素樣或抗雌激素樣的內(nèi)

2、分泌干擾作用，造成嚴(yán)重的生殖與發(fā)育障礙。在人類生殖領(lǐng)域，不孕不育夫婦日益增多且很多仍面臨當(dāng)今醫(yī)學(xué)尚無(wú)法解釋的原因，這促使我們不得不思考TCDD等環(huán)境內(nèi)分泌干擾物對(duì)人類生殖影響的程度和范圍實(shí)際上可能遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)我們既往的估計(jì)，人類的繁衍正面臨著巨大的潛在威脅。然而，目前對(duì)TCDD生殖損害的閾值及機(jī)理還知之甚少，致使在臨床上還未能采取有針對(duì)性的診治措施。本研究采用TCDD染毒體外原代培養(yǎng)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞，旨在探討TCDD對(duì)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞的毒性

3、閾值與作用機(jī)制，驗(yàn)證TCDD是否通過(guò)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激來(lái)誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞凋亡發(fā)生，而抑制卵巢顆粒細(xì)胞的甾體激素的合成和分泌，進(jìn)而構(gòu)成TCDD對(duì)人類生殖的毒性機(jī)制，從而為進(jìn)一步探索臨床防治措施提供應(yīng)用基礎(chǔ)性知識(shí)。 第一部分：TCDD對(duì)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞雌二醇和孕酮分泌的影響 文獻(xiàn)提示TCDD對(duì)人類生殖健康的影響主要是通過(guò)抑制卵巢甾體激素生成途徑。關(guān)于TCDD抑制卵巢顆粒細(xì)胞E2的分泌已有定論，但其作用的具體劑量、機(jī)制和是否抑制P的分泌

4、尚存在爭(zhēng)議。本實(shí)驗(yàn)采用TCDD染毒體外培養(yǎng)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞，檢測(cè)TCDD對(duì)細(xì)胞活力和E2、P分泌的影響。 方法： ①25-29D雌性SD大鼠4只，腹腔注射孕馬血清(PMSG)50IU，48h后對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)。 ②細(xì)胞貼壁后換液繼續(xù)培養(yǎng)24h，分別加入0.1、1、10、100nMTCDD刺激24h和10nMTCDD刺激0、1、3、6、18、24h，并設(shè)正常對(duì)照和0.1％DMSO陰性對(duì)照組。 ③采

5、用MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞活力，RIA法檢測(cè)各組收集培養(yǎng)液中的E2和P值。 ④每實(shí)驗(yàn)組均設(shè)三個(gè)復(fù)孔。 小結(jié)： ①TCDD顯著抑制細(xì)胞活力，1nMTCDD刺激24h或10hMTCDD刺激3h即可明顯降低細(xì)胞活性，提示TCDD對(duì)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞的毒性作用閾值可能為1nM或更低。 ②TCDD明顯抑制大鼠卵巢顆粒細(xì)胞E2和P分泌，大于1nMTCDD顯著抑制大鼠卵巢顆粒細(xì)胞E2和P分泌，提示TCDD的生殖毒性作用可能與

6、直接對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞的毒性作用和抑制甾體激素的生物合成以及分泌有關(guān)。 ③TCDD抑制大鼠卵巢顆粒細(xì)胞活力和E2、P分泌具有劑量-時(shí)間依賴關(guān)系。 第二部分：TCDD誘導(dǎo)原代培養(yǎng)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞的氧化應(yīng)激和凋亡 許多研究報(bào)道TCDD通過(guò)氧化應(yīng)激介導(dǎo)對(duì)一般細(xì)胞的毒性作用。但是，關(guān)于TCDD是否通過(guò)活性氧(ROS)機(jī)制誘導(dǎo)卵巢顆粒細(xì)胞凋亡并影響甾體激素分泌的研究未見報(bào)道。本研究探討TCDD對(duì)體外原代培養(yǎng)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞的氧

7、化應(yīng)激和凋亡的影響，進(jìn)一步探索ROS在介導(dǎo)TCDD誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞凋亡中的作用。 方法： ①25-29D雌性SD大鼠80只，對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)。 ②細(xì)胞貼壁后繼續(xù)培養(yǎng)24h，分別加入0.1、1、10、100nMTCDD刺激24h和10nMTCDD刺激不同時(shí)間段。并設(shè)正常對(duì)照組和0.1％DMSO陰性對(duì)照組 ③采用AnnexinV-FITC／PI雙染流式檢測(cè)不同劑量TCDD刺激24h和10nM刺激0、1、

8、3、6、18、24h的細(xì)胞凋亡率；并采用TUNEL-FITC／Hoechst33258熒光雙染進(jìn)一步印證TCDD誘發(fā)顆粒細(xì)胞的凋亡。 ④檢測(cè)10nMTCDD刺激0、0.5、1、5、24h后細(xì)胞內(nèi)ROS、丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)水平。 ⑤檢測(cè)10nMTCDD聯(lián)合50、100、150u／mlSOD刺激5h后細(xì)胞內(nèi)ROS量以及10nMTCDD聯(lián)合100u／mlSOD刺激0、1、3、6、18、24h的細(xì)胞凋亡率。

9、 ⑥每實(shí)驗(yàn)組均設(shè)三個(gè)復(fù)孔。 小結(jié)： ①體外培養(yǎng)的大鼠顆粒細(xì)胞暴露于10nMTCDD1h或1nMTCDD24h早期凋亡發(fā)生顯著增加，10、100nM劑量誘導(dǎo)晚期凋亡和細(xì)胞死亡增加明顯。并且TCDD刺激18h前引起早期凋亡發(fā)生遞增，而作用24h時(shí)主要誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞晚期凋亡和細(xì)胞死亡的增加。具有劑量-時(shí)間依賴關(guān)系。采用TLINEL-FITC／Hoechst33258熒光雙染對(duì)比印證TCDD誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞的凋亡。提示TCDD引起

10、顆粒細(xì)胞凋亡的閾值為1nM或更低。 ②10nMTCDD暴露不同時(shí)間均誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞ROS生成增加顯著，較對(duì)照組ROS增加達(dá)1.9-3.4倍不等，5h時(shí)達(dá)到頂峰，24h后降低到1h水平。且TCDD誘導(dǎo)卵巢顆粒細(xì)胞內(nèi)MDA增加和GSH損耗與ROS生成一致。提示10nMTCDD刺激短時(shí)間即可誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞的氧化損傷作用，具有時(shí)間依賴關(guān)系。 ③10nMTCDD刺激不同時(shí)間誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞ROS生成和凋亡發(fā)生增加一致，且ROS抑制劑-SO