哺乳期低劑量暴露2，3，7，8-四氯二苯-對(duì)-二噁英對(duì)仔鼠免疫器官CYP1A1表達(dá)和凋亡的影響.pdf

1、目的：
　　 二噁英類化學(xué)物質(zhì)是多氯代二苯并二噁英（PCDDs）、多氯代二苯并呋喃（PCDFs）和共面多氯聯(lián)苯（PCBs）的總稱，其中以2，3，7，8-四氯代二苯并一對(duì)一二噁英（2，3，7，8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin，TCDD）毒性最強(qiáng)。由于TCDD結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，通過食物鏈進(jìn)入人體后，在動(dòng)物和人的脂肪中蓄積，對(duì)人體健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅，因而被世界衛(wèi)生組織（World Health Organization

2、，WHO）作為新的環(huán)境污染物列入全球環(huán)境監(jiān)測(cè)計(jì)劃食品部分的監(jiān)測(cè)對(duì)象名單。
　　 由于有關(guān)哺乳期暴露于TCDD對(duì)子代影響的研究還不多見，所以本研究在雌性小鼠分娩后立即經(jīng)腹腔注射低劑量TCDD，通過乳汁對(duì)仔鼠染毒，然后觀察哺乳期暴露于TCDD對(duì)仔鼠體重增長(zhǎng)、胸腺和脾臟發(fā)育的影響，胸腺和脾臟組織結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞色素P4501A1酶（cytochrome P4501A1，CYP1A1）、凋亡基因Bcl-2（B-Cell lymphoma/l

3、eukemia2）和Bax（Bcl-associated x protein）蛋白表達(dá)的變化，為低劑量TCDD造成的子代慢性免疫器官危害及其機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
　　 4月齡健康成年昆明小鼠，雌鼠24只，雄鼠8只，按照3：1的雌雄比例同籠受孕。分娩7～10只仔鼠的整窩保留，調(diào)整每窩仔鼠為8只，雌雄對(duì)半，其余淘汰。
　　 2.試劑
　　 TCDD濃度為10μg/ml（

4、TCDD/甲苯），純度為99％，腹腔注射前將該試劑用花生油稀釋，體積比為TCDD：花生油=1：4，則濃度稀釋為2μg/ml。溶劑對(duì)照為甲苯和花生油按1：4體積比混合的混合液。
　　 3.分組
　　 將母鼠和仔鼠作為整體（窩）進(jìn)行完全隨機(jī)分為5組（每組3窩）：40μg和20μg TCDD/kg體重組，40μg和20μg溶劑/kg體重對(duì)照組，1個(gè)不做任何處理的空白對(duì)照組。5個(gè)實(shí)驗(yàn)組以下簡(jiǎn)寫為40μg TCDD組、20μg T

5、CDD組、40μg溶劑對(duì)照組、20μg溶劑對(duì)照組和空白對(duì)照組。雌鼠分娩后，立即稱重并腹腔注射。經(jīng)母鼠哺乳染毒至仔鼠出生后第21天，隨后仔鼠自由進(jìn)食。仔鼠出生后第35天被處死。
　　 4仔鼠體重的測(cè)定
　　 5.仔鼠免疫器官發(fā)育指標(biāo)（胸腺重量、胸腺指數(shù)、脾臟重量、脾臟指數(shù)）的測(cè)定
　　 6.仔鼠胸腺和脾臟組織CYP1A1蛋白定位和半定量分析
　　 7.仔鼠胸腺和脾臟組織細(xì)胞凋亡的測(cè)定
　　 7.1采

6、用H.E染色法觀察仔鼠胸腺和脾臟組織的結(jié)構(gòu)變化。
　　 7.2采用免疫組織化學(xué)染色法對(duì)仔鼠胸腺和脾臟組織Bcl-2和Bax凋亡蛋白進(jìn)行定位和半定量分析。
　　 結(jié)果：
　　 1.FCDD對(duì)仔鼠體重的影響
　　 新生仔鼠體重?zé)o顯著性差異（P>0.05）；出生后第7天開始，20μg TCDD組仔鼠的平均體重低于其溶劑對(duì)照組和空白對(duì)照組（P<0.05）；隨著TCDD的攝入和蓄積，40μg和20μgTCDD組仔鼠

7、的平均體重均低于相應(yīng)的溶劑對(duì)照組和空白對(duì)照組（P<0.05），并且40μg TCDD組仔鼠的平均體重低于20μg TCDD組（P<0.05）；停止染毒后（出生后第28天和第35天），暴露于TCDD仔鼠的平均體重依然低于相應(yīng)的溶劑對(duì)照組和空白對(duì)照組（P<0.05）。
　　 2.TCDD對(duì)仔鼠免疫器官重量的影響
　　 2.1 TCDD對(duì)仔鼠胸腺重量的影響
　　 雄性和雌性仔鼠的40μg和20μg TCDD組胸腺重量與

8、相應(yīng)的對(duì)照組之間均不具有顯著性差異；雄性40μg和20μg TCDD組胸腺指數(shù)分別高于相應(yīng)的溶劑對(duì)照組（P<0.05），雌性之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 2.2 TCDD對(duì)仔鼠脾臟重量的影響
　　 雄性和雌性仔鼠的40μg和20μg TCDD組的脾臟重量與相應(yīng)的溶劑對(duì)照組之間均無顯著性差異；雄性40μg TCDD組脾臟指數(shù)高于20μg TCDD組和相應(yīng)對(duì)照組（P<0.05），雌性之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 以上結(jié)果提示

9、哺乳期暴露于TCDD可以導(dǎo)致雄性仔鼠免疫器官指數(shù)升高，而雌性仔鼠無明顯變化。
　　 3.TCDD對(duì)仔鼠胸腺和脾臟組織CYP1A1蛋白表達(dá)的影響
　　 CYP1A1蛋白主要表達(dá)于仔鼠胸腺和脾臟淋巴細(xì)胞的線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。哺乳期低劑量暴露于TCDD，無論雌性和雄性仔鼠，其40μg和20μg TCDD組胸腺和脾臟組織淋巴細(xì)胞CYP1A1蛋白的表達(dá)均增高（P<0.05），并且各組雌性仔鼠的CYP1A1蛋白表達(dá)高于雄性仔鼠（P<0

10、.05）。
　　 4.TCDD對(duì)仔鼠胸腺和脾臟組織細(xì)胞凋亡的影響
　　 哺乳期低劑量暴露于TCDD，仔鼠40μg和20μg TCDD組胸腺和脾臟組織淋巴細(xì)胞排列紊亂，胞體皺縮，核染色質(zhì)濃集，呈現(xiàn)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。
　　 凋亡基因Bcl-2和Bax主要表達(dá)于仔鼠胸腺和脾臟淋巴細(xì)胞胞漿中。哺乳期低劑量暴露于TCDD可使雌性和雄性仔鼠的胸腺和脾臟細(xì)胞Bcl-2蛋白的表達(dá)減低（P<0.05），但雌性仔鼠Bcl-2蛋白表達(dá)始終

11、高于雄性（P<0.05）。
　　 凋亡基因Bax主要表達(dá)于仔鼠胸腺和脾臟淋巴細(xì)胞的胞漿和胞核中。哺乳期低劑量暴露于TCDD使雌性和雄性仔鼠胸腺和脾臟淋巴細(xì)胞Bax蛋白的表達(dá)均明顯增高（P<0.05），并且雌性仔鼠增高較雄性明顯，存在性別差異（P<0.05）。
　　 哺乳期低劑量暴露于TCDD使雌性和雄性仔鼠40μg和20μg。TCDD組胸腺和脾臟淋巴細(xì)胞Bcl-2/Bax比值均降低（P<0.05），說明TCDD可以誘導(dǎo)仔

12、鼠胸腺和脾臟組織淋巴細(xì)胞凋亡。
　　 結(jié)論：
　　 1.哺乳期低劑量暴露于TCDD，可以阻礙仔鼠的體重增長(zhǎng)，并且這種阻礙作用并不隨著染毒的停止而停止，具有持續(xù)性。
　　 2.哺乳期低劑量暴露于TCDD，可以使雄性仔鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)顯著增高，對(duì)雌性仔鼠沒有影響。TCDD對(duì)子代小鼠的免疫毒性作用是否存在性別差異還需進(jìn)一步研究證實(shí)。
　　 3.哺乳期低劑量暴露于TCDD，可以使仔鼠胸腺和脾臟組織CPY1A

13、1蛋白表達(dá)增加，同時(shí)雌性CYP1A1蛋白表達(dá)高于雄性， TCDD對(duì)仔鼠免疫器官的影響存在性別差異。
　　 4.哺乳期低劑量暴露于TCDD，可以誘導(dǎo)胸腺和脾臟淋巴細(xì)胞呈現(xiàn)凋亡改變，使Bcl-2蛋白表達(dá)減低，Bax蛋白表達(dá)增高，Bcl-2/Bax比值降低。Bcl-2凋亡基因家族比值的改變可能是TCDD導(dǎo)致細(xì)胞異常凋亡的重要機(jī)制之一，也可能是TCDD導(dǎo)致免疫功能抑制的原因之一。并且Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的雌雄差異，可能是雌雄仔鼠對(duì)