GRIM-19及其靶基因產(chǎn)物P-STAT3與人肝細(xì)胞肝癌的相關(guān)性研究.pdf

1、研究背景與目的：
　　 肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是源自肝細(xì)胞的惡性腫瘤，是原發(fā)性肝癌中最常見的一種病理類型，世界上平均每年死于HCC的人數(shù)約有1，250，000，HCC的發(fā)生、發(fā)展是一個多基因參與的復(fù)雜過程。目前針對HCC的治療，主要是外科手術(shù)切除病灶或者是通過介入手段進(jìn)行局部化療栓塞治療，對HCC患者進(jìn)行放療和全身化療的療效均不理想。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，免疫治療和基因治療等生物治

2、療方法作為繼手術(shù)、化療、放療之后的第四種治療模式，日益受到重視。
　　 GRIMs(genes associated with retinoid-IFN-induced mortality)是新近由Kalvakolanu在研究干擾素(interferon，IFN)和維甲酸(retinoic acid，RA)合并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡時發(fā)現(xiàn)的一組參與細(xì)胞凋亡的基因，共24種，GRIM-19是其中最具代表性的一種。GRIM-19編碼含144個

3、氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，分子量約16KD，定位于19p13.1，是一種保守基因，可以在多種正常組織中表達(dá)。目前GRIM-19蛋白的細(xì)胞定位存在爭議，有研究認(rèn)為GRIM-19主要定位于細(xì)胞核，也有研究認(rèn)為GRIM-19主要表達(dá)于胞漿中的線粒體。Lufei等則認(rèn)為GRIM-19的定位因細(xì)胞種類不同而存在差異，目前國內(nèi)外對GRIM-19在肝癌組織中的表達(dá)及功能都尚未見報道。研究表明，GRIM-19參與細(xì)胞增殖、凋亡的調(diào)控過程，該基因表達(dá)的降低或者

4、位點(diǎn)的突變可以導(dǎo)致細(xì)胞的異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化，GRIM-19在肝細(xì)胞癌變的過程中發(fā)揮了怎樣的作用，值得我們深入探討。
　　 GRIM-19可以特異性的與組成性活化的STAT3偶聯(lián)，從而抑制其轉(zhuǎn)錄活性，并抑制腫瘤生長，對腫瘤治療有巨大的潛在價值。這一機(jī)制在腎細(xì)胞癌、部分前列腺癌、HPV感染的富頸癌等部分腫瘤組織中都有所報道。但在肝癌方面，只在體外培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞中有過報道。STAT3可以被多種病毒致癌蛋白所激活，STAT3的組成

5、性活化能促進(jìn)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化并阻斷其凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，血管形成，因此，阻斷STAT3的表達(dá)對腫瘤的治療具有巨大的潛在價值。深入研究GRIM-19與p-STAT3的關(guān)系，探討其對細(xì)胞轉(zhuǎn)化、增殖、凋亡的調(diào)控機(jī)制，將有利于闡明肝癌的發(fā)生機(jī)制。
　　 GRIM-19是由RA和IFNs合并誘導(dǎo)細(xì)胞時發(fā)現(xiàn)的參與細(xì)胞凋亡的基因。維甲酸是維生素A在體內(nèi)產(chǎn)生的衍生物，屬于分化誘導(dǎo)劑類，具有逆轉(zhuǎn)癌前病變，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化，提高腫瘤細(xì)胞對化療的

6、敏感性等作用;干擾素則通過與細(xì)胞表面受體結(jié)合，激活包括JAK-STAT途徑、干擾素調(diào)節(jié)因子在內(nèi)的多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，直接抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。在臨床上，單用維甲酸和干擾素治療腫瘤的研究較多，聯(lián)合治療腫瘤的研究比較少，兩藥聯(lián)合對肝癌細(xì)胞的影響及其誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制尚不清楚。目前針對GRIM-19基因的生物學(xué)功能及作用機(jī)制的研究尚處于起步階段，進(jìn)一步認(rèn)識其蛋白的功能、調(diào)節(jié)方式及其作用機(jī)制，將為深入了解腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展提供新的線索，為腫瘤的診斷、

7、治療提供新的靶點(diǎn)和研究方向。
　　 第一部分：GRIM-19及p-STAT3在人肝細(xì)胞肝癌中的表達(dá)及臨床意義
　　 研究目的：
　　 1.檢測GRIM-19在原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌和癌旁組織中的表達(dá)及定位。
　　 2.檢測p-STAT3在原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌和癌旁組織中的表達(dá)及定位。
　　 3.分析GRIM-19及其靶基因STAT3、p-STAT3、VEGF在肝癌和癌旁組織中的相關(guān)性。
　　 4.分

8、析GRIM-19與原發(fā)性肝癌的病因、病理類型、分化程度等臨床特征的相關(guān)性。
　　 研究方法：
　　 1.收集55例手術(shù)之前未經(jīng)任何治療的原發(fā)性肝癌患者的臨床資料及經(jīng)手術(shù)切除的肝細(xì)胞癌組織及鄰近的非癌肝組織（鄰近非癌肝組織:肉眼觀正常，且距離腫瘤組織邊緣5cm以上），組織標(biāo)本于手術(shù)切除后盡快采集，經(jīng)脫水、石蠟包埋后切片，采用免疫組織化學(xué)染色法，檢測GRIM-19和p-STAT3在肝癌組織和非癌肝組織中的表達(dá)和定位。

9、　　 2.分別提取肝癌及癌旁肝組織的總蛋白和核蛋白，通過WesternBlot的方法檢測GRIM-19蛋白的表達(dá)情況。
　　 3.分別提取肝癌及癌旁肝組織的RNA，通過RT-PCR檢測GRIM-19在mRNA水平的表達(dá)情況。
　　 4.分別提取肝癌及癌旁肝組織的總蛋白，通過WesternBlot的方法檢測GRIM-19及其靶基因STAT3、p-STAT3、VEGF的表達(dá)情況。
　　 5.分析GRIM-19與臨床

10、病理特征的相關(guān)性。
　　 結(jié)果：
　　 1.免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判讀。
　　 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果由與本研究無關(guān)的兩名病理醫(yī)生評定，每張切片觀察5～6個400×視野，計數(shù)不少于100個細(xì)胞，依據(jù)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行分級，染色強(qiáng)度記分為四個等級:陰性:陽性細(xì)胞數(shù)少于5％，以“-”表示;弱陽性:陽性細(xì)胞數(shù)在5％～25％之間，以“+”表示;中等陽性:陽性細(xì)胞數(shù)在25％～50％之間，以“++”表示;強(qiáng)陽性:陽性細(xì)胞數(shù)

11、在50％～100％之間，以“+++”表示。
　　 2.GRIM-19在肝細(xì)胞癌、非癌肝組織中的表達(dá)和定位。
　　 ①免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示:在非癌肝組織中，GRIM-19蛋白陽性產(chǎn)物主要分布在細(xì)胞質(zhì)，亦有少量陽性產(chǎn)物分布在細(xì)胞核，表現(xiàn)為不同染色程度的黃色或棕黃色顆粒;而在肝細(xì)胞癌組織中，GRIM-19陽性產(chǎn)物只存在于細(xì)胞質(zhì)。
　　 ②分別提取肝細(xì)胞癌及癌旁組織的核蛋白，Western Blot檢測結(jié)果顯示:GR

12、IM-19蛋白在肝癌細(xì)胞核蛋白中的表達(dá)明顯低于癌旁肝細(xì)胞的核蛋白(P＜0.001)。
　　 3.GRIM-19在肝細(xì)胞癌和癌旁肝組織中的表達(dá)水平。
　　 ①免疫組織化學(xué)染色法結(jié)果顯示:GRIM-19蛋白在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)明顯低于癌旁肝組織。對照組4例正常肝組織中GRIM-19表達(dá)陽性的有3例(3/4，75％);55例癌旁肝組織中GRIM-19表達(dá)陽性的有40例(40/55，72.7％);而55例肝細(xì)胞癌組織中GRIM

13、-19表達(dá)陽性的只有25例(25/55，45.5％)。16例不伴隨肝纖維化的癌旁組織中有12例GRIM-19表達(dá)陽性(12/16，75％);39例伴隨肝纖維化的癌旁組織中有28例GRIM-19表達(dá)陽性(28/39，71.8％)，不伴隨肝纖維化的癌旁組織與伴隨肝纖維化的癌旁組織比較，GRIM-19蛋白的表達(dá)無明顯差異(p＞0.05)。GRIM-19在肝癌組織中的表達(dá)明顯低于癌旁組織(p＜0.05)，甚至表達(dá)缺失。另外，65例GRIM-19

14、表達(dá)陽性的肝組織中有23例為++～+++（按結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)分為中等陽性），在這23例中等陽性標(biāo)本中有20例是癌旁組織(20/23，87％)。
　　 ②Western Blot和RT-PCR檢測，結(jié)果進(jìn)行灰度分析顯示:GRIM-19蛋白在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)水平明顯低于鄰近的非癌肝組織(p＜0.001)。普通RT-PCR檢測結(jié)果顯示，GRIM-19mRNA在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)水平明顯低于鄰近的非癌肝組織(p＜0.001)。QRT-

15、PCR檢測結(jié)果顯示，GRIM-19mRNA在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)水平約為癌旁組織的1/6～1/2不等。
　　 4.p-STAT3在肝細(xì)胞癌、非癌肝組織中的表達(dá)及定位。
　　 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示:在肝癌組織中，P-STAT3蛋白陽性產(chǎn)物主要定位在細(xì)胞核，多呈散在或灶狀分布;P-STAT3蛋白在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁肝組織。55例肝癌組織中p-STAT3表達(dá)陽性的有47例(47/55，85.5％)，55例癌旁

16、肝組織中p-STAT3表達(dá)陽性的只有14例(14/55，25.5％)。12例組織病理分級為Ⅰ級的肝癌組織中p-STAT3表達(dá)陽性的有8例(8/12，66.7％)，43例組織病理分級為Ⅱ～Ⅲ級的肝細(xì)胞癌組織中p-STAT3表達(dá)陽性的有39例(39/43，90.7％)，39例非癌肝纖維化組織中p-STAT3表達(dá)陽性的有14例(14/55，25.5％)，而在16例非癌、非纖維化的肝組織中無p-STAT3的表達(dá)陽性者。在61例p-STAT3表達(dá)

17、陽性的病例中有40例染色為++～+++（按結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)為中等陽性，40/61，65.6％），在這40例中等陽性的病例中有35例為肝癌組織(35/40，87.5％)。
　　 5.GRIM-19與p-STAT3在原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌及癌旁組織中表達(dá)的相關(guān)性。
　　 提取55例患者肝癌及癌旁組織的總蛋白，通過WesternBlot檢測了GRIM-19和p-STAT3蛋白的表達(dá)情況，條帶經(jīng)灰度值分析，檢測結(jié)果經(jīng)配對t檢驗(yàn)分析顯示:肝

18、細(xì)胞癌組織中GRIM-19/β-actin灰度比值(0.29±0.18)明顯低于癌旁組織(0.61±0.11)(p＜0.05)，p-STAT3/β-actin的灰度比值，肝細(xì)胞癌中(0.94±0.36)明顯高于癌旁組織(0.23±0.12)(p＜0.05)，兩者經(jīng)Pearson相關(guān)檢驗(yàn)，相關(guān)系數(shù)r=-0.59，表明肝細(xì)胞肝癌組織中GRIM-19蛋白的表達(dá)與p-STAT3蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。
　　

19、 6.GRIM-19、p-STAT3、STAT3及VEGF在原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌及癌旁組織中的表達(dá)。
　　 隨機(jī)抽取了20例患者肝癌及癌旁組織，提取總蛋白，通過WesternBlot檢測GRIM-19、p-STAT3、STAT3以及p-STAT3的下游蛋白VEGF的表達(dá)情況，條帶經(jīng)灰度值分析，檢測結(jié)果經(jīng)配對t檢驗(yàn)分析顯示:肝癌組織中GRIM-19/β-actin灰度比值(0.28±0.12)明顯低于癌旁組織(0.64±0.21)(p

20、＜0.05);肝細(xì)胞肝癌中p-STAT3/β-actin的灰度比值(0.92±0.27)明顯高于癌旁組織(0.31±0.14)(p＜0.05)，與前期得出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。肝癌組織中STAT3/β-actin灰度比值(0.85±0.13)明顯高于癌旁組織(0.32±0.15)(p=0.008);肝細(xì)胞肝癌中VEGF/β-actin灰度比值(0.79±0.21)也明顯高于相應(yīng)的癌旁肝組織(0.36±0.20)(p=0.012)。
　　

21、 7.肝細(xì)胞癌組織中GRIM-19mRNA的表達(dá)水平與臨床病理特征的相關(guān)性。
　　 肝細(xì)胞癌組織中GRIM-19的表達(dá)水平與肝癌組織病理分級呈負(fù)相關(guān)(p=0.001)、血管侵襲呈負(fù)相關(guān)(p=0.032)、與臨床分期呈負(fù)相關(guān)(p=0.024);而與年齡、性別、HBV感染、甲胎蛋白(Serumα-fetoprotein)、纖維化水平、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等其他臨床病理特征無相關(guān)性。
　　 結(jié)論：
　　 1.在正常肝

22、組織中，GRIM-19主要分布在細(xì)胞質(zhì)，少量分布在細(xì)胞核;在肝癌組織中GRIM-19表達(dá)明顯低于癌旁組織，并且出現(xiàn)核表達(dá)缺失。
　　 2.在肝癌及癌旁組織中，p-STAT3主要分布在細(xì)胞核，p-STAT3在肝癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織。
　　 3.肝細(xì)胞肝癌組織中GRIM-19蛋白的表達(dá)與p-STAT3蛋白的表達(dá)呈明顯的負(fù)相關(guān)。
　　 4.肝細(xì)胞癌組織中GRIM-19的表達(dá)水平與肝癌組織病理分級、血管侵襲

23、、與臨床分期呈負(fù)相關(guān);而與年齡、性別、HBV感染、甲胎蛋白、纖維化水平、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等其他臨床病理特征無相關(guān)性。
　　 第二部分：全反式維甲酸聯(lián)合干擾素β對體外培養(yǎng)的人肝癌細(xì)胞增殖、凋亡及GRIM-19分子表達(dá)的影響
　　 研究目的：
　　 1.檢測GRIM-19在不同的肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況。
　　 2.探討維甲酸和干擾素β對肝癌細(xì)胞HepG2增殖、凋亡的影響。
　　 3.探討維甲酸和干

24、擾素β對肝癌細(xì)胞HepG2GRIM-19表達(dá)的影響。
　　 4.檢測維甲酸和干擾素β對肝癌細(xì)胞HepG2GRIM-19的靶基因STAT3、p-STAT3及VEGF表達(dá)水平的影響。
　　 研究方法：
　　 1.取傳代培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞株HepG2、MHCC-97H，同時以正常肝細(xì)胞株LO2作對照，檢測三種細(xì)胞株中內(nèi)源性的GRIM-19的表達(dá)情況。
　　 2.取傳代培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的干擾素

25、β(interferon-β，IFN-β)和維甲酸(retinoic acid，RA)，同時設(shè)空白對照組，培養(yǎng)不同的時間(24h、48h和72h)，通過MTT法檢測細(xì)胞增殖變化，找到干擾素β和維甲酸抑制肝癌細(xì)胞增殖的最適合的濃度和時間。
　　 3.取傳代培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞，根據(jù)MTT的結(jié)果選擇適宜的作用時間，加入不同濃度的維甲酸和干擾素β，流式細(xì)胞儀檢測維甲酸和干擾素β對細(xì)胞凋亡的影響。
　　 4.取傳代培養(yǎng)的HepG

26、2細(xì)胞，根據(jù)MTT的結(jié)果選擇適宜的作用時間，加入不同濃度的維甲酸和干擾素β，通過免疫熒光染色比較維甲酸和干擾素β對HepG2細(xì)胞中GRIM-19表達(dá)的影響。通過Western Blot分別檢測實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞總蛋白和核蛋白中GRIM-19表達(dá)水平的變化。
　　 5.Western Blot檢測實(shí)驗(yàn)組和對照組GRIM-19的靶基因STAT3、p-STAT3及VEGF的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：
　　 1、GRIM-

27、19在不同的肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)
　　 1)免疫熒光檢測結(jié)果顯示:正常人肝細(xì)胞株LO2及肝癌細(xì)胞株HepG2和MHCC-97H中均有內(nèi)源性GRIM-19的表達(dá)，其陽性產(chǎn)物主要定位在細(xì)胞質(zhì)，此外，正常人肝細(xì)胞LO2亦有少量陽性產(chǎn)物分布于細(xì)胞核內(nèi)，而肝癌細(xì)胞株HepG2和MHCC-97H則無細(xì)胞核表達(dá)，這一結(jié)果與前期肝癌及癌旁組織中GRIM-19蛋白的表達(dá)定位一致。另外，肝細(xì)胞株LO2中GRIM-19的熒光強(qiáng)度明顯高于肝癌細(xì)胞株Hep

28、G2和MHCC-97H。
　　 2)通過WesternBlot檢測內(nèi)源性GRIM-19蛋白在正常人肝細(xì)胞株LO2及肝癌細(xì)胞株HepG2和MHCC-97H中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示:內(nèi)源性的GRIM-19蛋白在正常人肝細(xì)胞株LO2中表達(dá)水平最高，在肝癌細(xì)胞株MHCC-97H中表達(dá)水平最低，在肝癌細(xì)胞株HepG2的表達(dá)水平介于LO2細(xì)胞和MHCC-97H細(xì)胞之間，三組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.001)。而STAT3、p-STAT

29、3和VEGF蛋白在三種細(xì)胞株中的表達(dá)，則以MHCC-97H細(xì)胞最高，LO2細(xì)胞最低，HepG2細(xì)胞介于LO2細(xì)胞和MHCC-97H細(xì)胞之間，三組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.001)。
　　 3)通過RT-PCR檢測內(nèi)源性GRIM-19mRNA在正常人肝細(xì)胞株LO2及肝癌細(xì)胞株HepG2和MHCC-97H中的表達(dá)水平，結(jié)果與WesternBlot檢測結(jié)果一致:GRIM-19mRNA在正常人肝細(xì)胞LO2中表達(dá)水平最高，在肝癌細(xì)

30、胞MHCC-97H中表達(dá)水平最低，而在肝癌細(xì)胞HepG2中的表達(dá)水平介于LO2細(xì)胞和MHCC-97H細(xì)胞之間，三組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.001)。
　　 2、不同濃度的IFN-β及從單獨(dú)或共同作用對HepG2細(xì)胞的增殖抑制
　　 MTT結(jié)果顯示:不同濃度的IFN-β、RA單獨(dú)或聯(lián)合加入肝癌細(xì)胞株HepG2的培養(yǎng)液中，對HepG2細(xì)胞的增殖均有一定程度的抑制作用，并且呈明顯的濃度依賴性和作用時間相關(guān)性。此外，聯(lián)

31、合用藥比單獨(dú)用藥對細(xì)胞增殖的抑制作用更強(qiáng)，聯(lián)合用藥組對HepG2細(xì)胞的增殖抑制率分別與相同濃度相同作用時間的單獨(dú)用藥組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。我們同時發(fā)現(xiàn)IFN-β/RA聯(lián)合用藥濃度過大或作用時間過長均對HepG2細(xì)胞有毒性反應(yīng)，在IFN-β4500u/ml+RA9μmol/L聯(lián)合作用組和所有72h組均觀察到較多的死亡細(xì)胞，而在IFN-β1500u/ml+RA3μmol/L聯(lián)合作用48h組未看到明顯的死亡細(xì)胞。因此，

32、在以下實(shí)驗(yàn)中，我們選擇采用IFN-β1500u/ml+RA3μmol/L作為最佳干預(yù)濃度，48h作為最佳干預(yù)時間進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
　　 3、IFN-β/RA聯(lián)合用藥可促進(jìn)HepG2細(xì)胞凋亡
　　 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示:不同濃度的IFN-β+RA聯(lián)合加入肝癌細(xì)胞株HepG2的培養(yǎng)液中作用48h時，HepG2細(xì)胞凋亡指數(shù)隨藥物濃度的增加而增加，對照組HepG2細(xì)胞的凋亡指數(shù)平均為4.27±1.02，IFN-β500u/ml+RA

33、1μmol/L共同作用48h組，HepG2細(xì)胞凋亡指數(shù)平均為9.32±1.16;IFN-β1500u/ml+RA3μmol/L共同作用48h組，HepG2細(xì)胞凋亡指數(shù)平均為16.34±2.71;IFN-β4500u/ml+RA9μmol/L共同作用48h組，HepG2細(xì)胞凋亡指數(shù)平均為39.61±6.55。四組凋亡指數(shù)比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義((P)＜0.05）;三個處理組分別與對照組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義((P)＜0.05）。

34、r>　　 4、IFN-β/RA可誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞內(nèi)源性GRIM-19表達(dá)增加，并出現(xiàn)GGRI-19的核表達(dá)陽性
　　 1)細(xì)胞免疫熒光檢測HepG2細(xì)胞在IFN-β/RA作用前后GRIM-19蛋白的表達(dá)變化，結(jié)果顯示:對照組HepG2細(xì)胞中GRIM-19蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)，無細(xì)胞核表達(dá);而IFN-β/RA處理組除了細(xì)胞體積增大外，出現(xiàn)GRIM-19的核表達(dá)陽性，GRIM-19熒光強(qiáng)度比對照組明顯增強(qiáng)，并且隨IFN-β/RA

35、濃度增加，GRIM-19蛋白的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。
　　 2)收集經(jīng)IFN-β1500u/ml+RA3μmol/L作用48h后的HepG2細(xì)胞分別提取總蛋白和核蛋白，通過Western Blot檢測了GRIM-19蛋白的表達(dá)情況，條帶經(jīng)灰度值分析，檢測結(jié)果經(jīng)t檢驗(yàn)分析顯示:實(shí)驗(yàn)組總蛋白中GRIM-19/β-actin灰度比值(1.36±0.37)明顯高于對照組（0.78±0.21）(p＜0.01);實(shí)驗(yàn)組核蛋白中GRIM-19/β

36、-actin灰度比值（0.56±0.19）亦明顯高于對照組(0.14±0.05)(p＜0.01)。
　　 3)收集經(jīng)IFN-β/RA處理后的HepG2細(xì)胞抽提mRNA行RT-PCR檢測，結(jié)果顯示:IFN-β500u/ml+RA1μmol/L作用48h時，GRIM-19mRNA表達(dá)較對照組增加，約為對照組的1.8倍;當(dāng)IFN-β1500u/ml+RA3μmol/L作用48h時，GRIM-19mRNA表達(dá)約為對照組的3.9倍;當(dāng)IF

37、N-β4500u/ml+RA9μmol/L作用48h時，GRIM-19mRNA表達(dá)程度最高，約為對照組的5.7倍。
　　 5、實(shí)驗(yàn)組GRIM-19的表達(dá)增加伴隨p-STAT3、STAT3、VEGF的表達(dá)下降
　　 收集經(jīng)不同濃度的IFN-β/RA作用48h的HepG2細(xì)胞提取總蛋白行Western Blot檢測，條帶經(jīng)灰度值分析，檢測結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組GRIM-19的表達(dá)水平均高于對照組(p＜0.05)，并且GRIM-19

38、的表達(dá)量隨藥物濃度的增加而增加;而p-STAT3、STAT3、VEGF蛋白在實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)均明顯低于對照組(p＜0.05)，并且表達(dá)水平隨藥物濃度的增加而降低。
　　 結(jié)論：
　　 1.內(nèi)源性GRIM-19在正常肝細(xì)胞株及肝癌細(xì)胞株中表達(dá)和定位不同。
　　 2.IFN-β和RA聯(lián)合作用可抑制肝癌細(xì)胞HepG2增殖，促進(jìn)其凋亡;同時，還可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞內(nèi)源性GRIM-19的表達(dá)，下調(diào)p-STAT3介導(dǎo)的VEGF的表達(dá)