GRIM-19在HCC中的表達及對HCC細胞遷移能力的影響.pdf

1、目的:肝細胞肝癌（HepatocellularcarcinomaHCC）是肝臟最常見的原發(fā)性腫瘤，是全球六大惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率顯著增長。因此加強對HCC的基礎研究顯得極為重要。以往研究發(fā)現(xiàn)維甲酸/干擾素聯(lián)合應用誘導細胞凋亡相關的基因(geneassociatedwithretinoid-interferon-inducedmortality19，GRIM—19)是一種腫瘤抑制基因，在多種惡性腫瘤中的表達水平較低，并且其蛋白表

2、達與細胞凋亡和細胞生長抑制有密切的聯(lián)系。本次實驗我們主要研究的目的是通過檢測GRIM-19mRNA在肝細胞肝癌的表達，分析其與臨床病理分期的聯(lián)系，并進一步通過構建GRIM-19kd和scr的細胞株HL-7701和Huh-7研究GRIM-19對HCC細胞遷移能力的影響。
　　 方法:
　　 1.應用實時定量聚合酶連反應技術研究GRIM-19mRNA在83例肝細胞肝癌及其癌旁肝組織和8例正常組織的表達情況，并分析其與臨床病理

3、的聯(lián)系;
　　 2.設計GRIM-19的敲除和對照序列，通過Trans1-T1PhageResistant化學感受態(tài)細菌，LA固體培養(yǎng)基篩選挑選陽性重組子。挑選好的陽性重組子通過LA液體培養(yǎng)基獲得大量包含GRIM-19質粒的細菌，通過質粒小提試劑盒獲得GRIM-19kd和scr的質粒。
　　 3.培養(yǎng)低侵襲力細胞株HL-7701、MHCC97-L和高侵襲力細胞株MHCC97-H、Huh-7，并通過WesternBlot檢

4、測GRIM-19蛋白在上述細胞株的表達。通過細胞轉染技術將GRIM-19kd和scr質粒轉染至HL-7701和Huh-7，用G-418進行篩選，從而構建GRIM-19kd和scr細胞株并用WesternBlot檢測是否構建成功。
　　 4.通過Transwell小室檢測HL-7701kd和scr、Huh-7kd和scr遷移能力，并用蘇木精染色方法檢測細胞數(shù)目，從而了解GRIM-19對HCC細胞遷移能力的影響。
　　 結果

5、:
　　 (1)實時定量聚合酶鏈反應技術結果示:肝細胞肝癌癌組織中GRIM-19mRNA表達低于與其相對癌旁肝組織中表達的共有52例，其陽性表達率為62.65％，差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。肝細胞肝癌癌組織中GRIM-19mRNA表達同正常肝組織相比，肝細胞肝癌的GRIM-19mRNA平均表達水平為，明顯低于GRIM-19mRNA在正常肝組織中的表達，差異有明顯性(P＜0.005)。
　　 (2)GRIM-1

6、9mRNA的表達與肝癌臨床病理相關性研究顯示:GRIM-19mRNA與肝細胞肝癌臨床TMN分期(P=0.011)、包膜浸潤（P=0.047）、微血管入侵（P=0.030）密切相關。從而提示GRIM-19的同HCC的細胞遷移存一定在的聯(lián)系。
　　 (3)WestemBlot結果顯示正常肝細胞株HL-7701，肝細胞肝癌細胞株MHCC97-L、MHCC-97H和Huh-7均表達GRIM-19蛋白，且低侵襲力HL-7701和MHCC9

7、7-L中GRIM-19蛋白的表達高于MHCC97-H和Huh-7。
　　 (4)WesternBlot結果顯示HL-7701kd細胞中GRIM-19蛋白的表達低于scr;Huh-7kd細胞中GRIM-19蛋白的表達低于scr，從而顯示GRIM-19的敲除細胞株構建成功。
　　 (5)Transwell小室結果顯示同scr相比，HL-7701kd細胞數(shù)增加了，而Huh-7kd的細胞數(shù)增加了，差異有明顯差異(P＜0.05)。

8、
　　 結論:
　　 1.GRIM-19mRNA在肝細胞肝癌組織的表達明顯低于相對應得癌旁肝組織和正常組織，說明GRIM-19mRNA在肝細胞肝癌中表達水平下調，并且GRIM-19mRNA低表達同肝細胞肝癌的臨床TMN分期、包膜浸潤和微血管入侵有密切的相關性。
　　 2.GRIM-19與HCC細胞的遷移能力密切相關，其低表達促進了HCC細胞得遷移能力，從而可能導致腫瘤的遠處轉移和擴散。
　　 3.GRIM