GRIM-19與E6AP相互作用的研究.pdf

1、背景:
　　子宮頸癌是最常見的惡性腫瘤之一,發(fā)病率位于女性惡性腫瘤的第二位。全世界每年大約有20萬婦女死于這種疾病。子宮頸癌的病因至今尚未完全明了,是多因素,多步驟發(fā)展的結果。高危型HPV的持續(xù)感染是導致宮頸癌發(fā)生的最危險的因素。當HPV感染宿主細胞后,通過整合宿主DNA能夠編碼早期癌蛋白E6。目前尚未發(fā)現(xiàn)E6蛋白具有酶活性,主要通過蛋白與蛋白的相互作用發(fā)揮致癌功能。研究發(fā)現(xiàn),E6在宮頸癌的致病過程中,E6AP幾乎介導了E6的全部

2、功能。首先E6與E6AP結合形成E6/E6AP復合體,然后與p53結合,E6AP將活化的泛素轉移至p53蛋白,p53則進入泛素化降解途徑,最終在蛋白酶體26S的作用下被降解。所以,E6AP的泛素化降解p53的功能對子宮頸癌的發(fā)生發(fā)展起著關鍵性的作用。
　　E6AP(E6-associated protien)基因又稱為UBE3A(ubiquitin protein ligase E3A),位于染色體15q11–q13,是HECT

3、E3(E3 homology tothe E6AP carboxy Terminus E3)蛋白家族成員。根據(jù)N端的不同,E6AP分為有三個轉錄本,Ⅰ型編碼98.9kDa;Ⅱ型編碼101.7kDa;Ⅲ編碼101.1kDa,三種亞型均具有蛋白降解的功能。E6AP的功能比較復雜,研究發(fā)現(xiàn),在應激狀態(tài)下,E6AP的表達水平顯著升高,與分子伴侶 Hsp70/Hsc70結合,能夠抑制應激誘導的細胞凋亡。在子宮頸癌的發(fā)病過程中,E6AP最重要的作用

4、就是能夠降解抑癌蛋白p53。E6與E6AP結合形成E6/E6AP復合體,與p53結合,E6AP將活化的泛素轉移至p53蛋白,引起p53的泛素化降解。E6AP在宮頸癌中的另外一個重要作用是上調端粒酶啟動子hTERT的表達,該機制與p53的降解無關。E6首先與E6AP結合,激活了c-Myc啟動子,促進c-Myc的轉錄,進一步激活hTERT的啟動子,通過誘導hTERT啟動子組蛋白H3的乙?；?促進hTERT的表達并提高端粒酶的活性。這充分說明

5、E6AP能夠促進子宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。
　　GRIMs(genes associated with retinoid-IFN-inducedmortality)是最近發(fā)現(xiàn)的一群參與干擾素(interferon,IFN)和維甲酸(retinoic acid,RA)合并誘導的細胞凋亡基因。GRIM-19屬GRIMs家族成員,是參與細胞線粒體的呼吸作用和調控細胞凋亡的新基因,定位于19p13.2,該區(qū)的多種基因為前列腺癌的抑制基因。編碼含

6、144個氨基酸殘基的蛋白質,分子量約16kD,表達于人體多種正常組織中,主要定位在線粒體,細胞核也有少量表達。GRIM-19的正常表達可以維持細胞正常生活周期,使細胞從衰老進入凋亡,低表達則使某些細胞不能正常地進入細胞凋亡周期,從而引發(fā)腫瘤的發(fā)生。如甲狀腺腫瘤、腎癌、口腔癌、結直腸癌等中均發(fā)現(xiàn)GRIM-19表達的降低。STAT3在許多腫瘤中處于持續(xù)激活狀態(tài),是腫瘤治療的新靶點。目前研究認為GRIM-19是STAT3表達和激活的負性調節(jié)子

7、,GRIM-19與其結合后,抑制其激活引起的下游基因的轉錄,這一結合作用是在GRIM-19的絲氨酸727轉激活位點完成的。研究還發(fā)現(xiàn),子宮頸癌HPV的E6蛋白可以與GRI M-19直接結合,且高危型HPV的結合作用強于低危型HPV。但是,GRIM-19在子宮頸細胞癌變的具體作用機制目前尚不清楚。
　　本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)子宮頸癌組織中GRIM-19表達顯著降低。同時通過體內實驗發(fā)現(xiàn),GRIM-19具有促進細胞凋亡的作用;進一步

8、的研究還發(fā)現(xiàn)在HPV陽性的子宮頸癌細胞株HeLa、SiHa和CaSki細胞中均發(fā)現(xiàn)GRIM-19可以上調p53的表達,而HPV陰性的卵巢癌細胞株H08910細胞中卻并未發(fā)現(xiàn)該現(xiàn)象,推論GRIM-19具有誘導子宮頸癌細胞株中p53蛋白積聚的重要作用,這種作用的發(fā)揮是依靠抑制p53蛋白的降解,延長其半衰期來實現(xiàn)的。而在子宮頸癌細胞中p53的降解主要是由于E6AP的泛素化降解作用。研究已經證實,GRIM-19能夠和許多細胞因子和蛋白分子發(fā)生直

9、接結合作用。所以,推測,GRIM-19可能與E6AP發(fā)生結合作用,從而抑制了E6AP泛素化降解p53的功能。本實驗在前期實驗的基礎上,將進一步研究GRIM-19與E6AP是否具有蛋白結合作用。
　　目的:
　　探討GRIM-19和E6AP是否具有蛋白結合作用,進一步闡述GRIM-19的抑癌機制及其在子宮頸癌發(fā)病中的作用,為臨床治療的應用提供理論和實驗依據(jù)。
　　方法:
　?、賀T-PCR方法明確E6AP三種轉錄本

10、在正常子宮頸組織和子宮頸癌組織中的表達情況;②采用免疫共沉淀方法(CO-IP)檢測GRIM-19與 E6AP蛋白體內結合作用;③E6AP-III各截斷體原核表達質粒的構建:pET-22b(+)-his-E6AP-III;④在大腸桿菌中誘導融合蛋白pET-22b(+)-his-E6AP-III各截斷體的表達
　　結果:
　?、賀T-PCR結果顯示E6AP在子宮頸癌組織中三種亞型均有表達,并且表達高于正常子宮頸組織,其中Ⅱ型表達

11、水平很低,主要以Ⅰ型和Ⅲ型為主;②免疫共沉淀(CO-IP)方法檢測結果顯示在子宮頸癌細胞株Hela,Siha,卵巢癌細胞株H08910中GRIM-19與E6AP具有蛋白結合作用;③E6AP-III各截斷體原核表達質粒構建成功;④在大腸桿菌中融合蛋白pET-22b(+)-his-E6AP-III各截斷體誘導表達成功.
　　結論:
　　GRIM-19與E6AP在體內水平具有蛋白結合作用,并且成功構建出E6AP-III各截斷體的原